1  范圍  

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中肉毒梭菌（Clostridium botulinum）及肉毒毒素（botulinum Toxin）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗(yàn)。

2  設(shè)備和材料 

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

a）冰箱：2℃～5℃、-20℃;

b）天平：感量0.1g;

c）無(wú)菌*、鑷子、試劑勺；

d）均質(zhì)器或無(wú)菌乳缽；

e）離心機(jī)：3000 rpm、14000 rpm

f）厭氧培養(yǎng)裝置；

g）恒溫培養(yǎng)箱：35℃±1℃、28℃±1℃；

h）恒溫水浴箱：37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃；

i）顯微鏡：10倍×100倍

j）PCR儀；

k）電泳儀或毛細(xì)管電泳儀；

l）凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測(cè)儀；

m）核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)；

n）可調(diào)微量移液器：0.2µL～2µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL；

o）無(wú)菌吸管：1.0mL、10.0 mL、25 .0mL；

p）無(wú)菌錐形瓶：100 mL；

q）培養(yǎng)皿：直徑90mm；

r）離心管：50mL、1.5mL；

s）PCR反應(yīng)管；

t）*：1.0mL；

u）小鼠：15g～20g，每一批次試驗(yàn)應(yīng)使用同一品系的KM或ICR小鼠。

3  培養(yǎng)基和試劑

除另有規(guī)定外，PCR試驗(yàn)所用試劑為分析純或符合生化試劑標(biāo)準(zhǔn)，水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。

3.1  庖肉培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.1。

3.2  *胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯（TPGYT）：見(jiàn)附錄A中A.2。

3.3  卵黃瓊脂培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中A.3。  

3.4  明膠磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)附錄A中A.4。

3.5  革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中A.5。

3.6  10%*溶液：見(jiàn)附錄A中A.6。

3.7  磷酸鹽緩沖液（PBS）：見(jiàn)附錄A中A.7。

3.8  1mol/L氫氧化鈉。

3.9  1mol/L鹽酸。

3.10  肉毒毒素診斷血清。

3.11  無(wú)水乙醇和95%乙醇。

3.12  10mg/mL*溶液。

3.13  10mg/mL蛋白酶K溶液。

3.14  3mol/L 乙酸鈉溶液（pH5.2）。

3.15  TE緩沖液。

3.16  引物：根據(jù)表1中序列合成，臨用時(shí)用超純水配制引物濃度為10 µmol/L。

3.17  10×PCR緩沖液。

3.18  25mmol/LMgCl2。

3.19  dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGCP。

3.20  Taq酶。

3.21  瓊脂糖：電泳級(jí)。

3.22  溴化乙錠或Goldview。

3.23  5×TBE緩沖液。

3.24  6×加樣緩沖液。

3.25  DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

4  檢驗(yàn)程序

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

5  操作步驟

5.1  樣品制備

5.1.1  樣品保存

待檢樣品（除未打開(kāi)的正常罐頭食品）和明顯膨脹的罐頭食品應(yīng)放2℃～5℃冰箱冷藏，直至檢驗(yàn)。

5.1.2  固態(tài)食品  

固體或游離液體很少的半固態(tài)食品，以無(wú)菌操作稱取樣品25g，放入無(wú)菌均質(zhì)袋或無(wú)菌乳缽，塊狀食品用無(wú)菌刀剪切碎，含水量較高的固態(tài)食品加入25mL明膠磷酸鹽緩沖液，乳粉、牛肉干等含水量低的食品加入50mL明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡30分鐘，用拍擊式均質(zhì)器拍打2min或用無(wú)菌研杵研磨制備樣品勻液，收集備用。

5.1.3  液態(tài)食品  

液態(tài)食品搖勻，直接量取25mL檢驗(yàn)。

5.1.4  樣品處理

取樣后的剩余樣品放2℃～5℃冰箱冷藏，直至檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告發(fā)出后，按感染性廢棄物要求進(jìn)行無(wú)害化處理，檢出陽(yáng)性的樣品應(yīng)采用壓力蒸汽滅菌方式進(jìn)行無(wú)害化處理。

5.2  肉毒毒素檢測(cè)

5.2.1  毒素液制備

取樣品勻液約40mL或均勻液體樣品25mL放入離心管，3000r/min，10min～20min離心，收集上清液分為兩份放入無(wú)菌試管中，一份直接用于毒素檢測(cè)，一份用于*處理后進(jìn)行毒素檢測(cè)，液體樣品保留底部沉淀液約12mL備用。

*處理：用1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至6.2，按9份上清液加1份10%*（活力1:250）水溶液，混勻，37℃孵育60min，期間間或輕輕搖動(dòng)反應(yīng)液。

5.2.2  檢出試驗(yàn)

用5號(hào)針頭注射器取離心上清液和*處理上清液分別腹腔注射小鼠三只，每只0.5mL，觀察和記錄小鼠48h中毒表現(xiàn)。小鼠在24h內(nèi)出現(xiàn)肉毒毒素中毒典型癥狀，多數(shù)在6h內(nèi)發(fā)病和死亡，其主要表現(xiàn)為豎毛、呼吸困難、四肢癱軟，呈現(xiàn)風(fēng)箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如蜂腰，因呼吸衰竭而死亡，可初步判定為毒素檢出。若小鼠在24h后發(fā)病或死亡，應(yīng)仔細(xì)觀察小鼠癥狀，必要時(shí)濃縮上清液重復(fù)試驗(yàn)，以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出現(xiàn)猝死（30min內(nèi)）導(dǎo)致癥狀不明顯時(shí)，可將毒素上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，重復(fù)試驗(yàn)。

注：毒素檢測(cè)動(dòng)物試驗(yàn)應(yīng)遵循《食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范》（GB15193.2）的規(guī)定。

5.2.3  確證試驗(yàn)

上清液或（和）*處理上清液的毒素檢出試驗(yàn)陽(yáng)性者，取相應(yīng)試驗(yàn)液三份，每份0.5mL，其中*份加等量多型混合肉毒毒素診斷血清，混勻，37℃孵育30min；第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min；第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻。將三份混合液分別腹腔注射小鼠各兩只，每只0.5mL，觀察96h。

結(jié)果判定：若注射*份和第二份混合液的小鼠未死亡，而第三份混合液小鼠發(fā)病死亡，并出現(xiàn)肉毒毒素中毒的*癥狀，則判定檢測(cè)樣品中檢出肉毒毒素。

5.2.4  毒力測(cè)定（選做項(xiàng)目）

取確證試驗(yàn)陽(yáng)性的試驗(yàn)液，用明膠磷酸鹽緩沖液稀釋制備一定倍數(shù)稀釋液，如10倍、50倍、100倍、500倍等，分別腹腔注射小鼠各兩只，每只0.5mL，觀察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至96h，計(jì)算zui低致死劑量MLD/mL或MLD/g，評(píng)估樣品中肉毒毒素毒力，MLD等于小鼠全部死亡的zui高稀釋倍數(shù)乘以樣品試驗(yàn)液稀釋倍數(shù)。例如，樣品稀釋兩倍制備的上清液，再稀釋100倍試驗(yàn)液使小鼠全部死亡，而500倍稀釋液組存活，則該樣品毒力為200MLD/g。

5.2.5  定型試驗(yàn)（選做項(xiàng)目）

根據(jù)毒力測(cè)定結(jié)果，用明膠磷酸鹽緩沖液將上清液稀釋至10～1000MLD/mL作為定型試驗(yàn)液，分別與各單型肉毒毒素診斷血清等量混合（國(guó)產(chǎn)診斷血清一般為凍干血清，用1mL生理鹽水溶解，能中和10000LD50的相應(yīng)毒素），37℃孵育30min，分別腹腔注射小鼠兩只，每只0.5mL，觀察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至96h。同時(shí)，用明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與試驗(yàn)液等量混合作為小鼠試驗(yàn)對(duì)照。

結(jié)果判定：某一單型診斷血清組動(dòng)物未發(fā)病且正常存活，而對(duì)照組和其他單型診斷血清組動(dòng)物發(fā)病死亡，則判定樣品中所含肉毒毒素為該型肉毒毒素。

注：未經(jīng)*激活處理的樣品上清液的毒素檢出試驗(yàn)或確證試驗(yàn)為陽(yáng)性者，則毒力測(cè)定和定型試驗(yàn)可省略*激活處理試驗(yàn)。

5.3  肉毒梭菌檢驗(yàn)

5.3.1  增菌培養(yǎng)與檢出試驗(yàn)

5.3.1.1  取出庖肉培養(yǎng)基4支和TPGY肉湯管2支，隔水煮沸10min-15min，排除溶解氧，迅速冷卻，切勿搖動(dòng)，在TPGY肉湯管中緩慢加入*液至液體石蠟液面下肉湯中，每支1mL，制備成TPGYT。

5.3.1.2   吸取樣品勻液或毒素制備過(guò)程中的離心沉淀液2mL接種至庖肉培養(yǎng)基中，每份樣品接種4支，2支直接放置35℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d，另2支放80℃保溫10min，再放置35℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d；同樣方法接種2支 TPGYT肉湯管， 28℃±1℃厭氧培養(yǎng)至5d。接種時(shí)將樣品液吸管慢慢穿過(guò)肉湯液面接種到肉湯管底部，切勿攪動(dòng)。

5.3.1.3  檢查記錄增菌培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉渣顆粒消化情況，并注意氣味。肉毒梭菌培養(yǎng)物為產(chǎn)氣、肉湯渾濁（庖肉培養(yǎng)基中A型和B型肉毒梭菌肉湯變黑）、消化或不消化肉粒、有異臭味。

5.3.1.4  將增菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)，注意是否有芽胞、芽胞的相對(duì)比例、芽胞在細(xì)胞內(nèi)的位置。

5.3.1.5  若增菌培養(yǎng)物5d無(wú)菌生長(zhǎng),應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)至10d，觀察生長(zhǎng)情況。

5.3.1.6  取增菌培養(yǎng)物陽(yáng)性管的上清液，按5.2方法進(jìn)行毒素檢出和確證試驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行定型試驗(yàn)，陽(yáng)性結(jié)果可證明樣品中有肉毒梭菌存在。

注：TPGYT增菌液的毒素試驗(yàn)無(wú)需添加*處理。

5.3.2  分離與純化培養(yǎng)

5.3.2.1  增菌液前處理，吸取1mL增菌液至無(wú)菌螺旋帽試管中，加入等體積過(guò)濾除菌的無(wú)水乙醇，混勻，在室溫下放置1h。

5.3.2.2  取增菌培養(yǎng)物和經(jīng)乙醇處理的增菌液分別劃線接種至卵黃瓊脂平板，35℃±1℃厭氧培養(yǎng)48h。

5.3.2.3  觀察平板培養(yǎng)物菌落形態(tài)，肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙，易成蔓延生長(zhǎng)，邊緣不規(guī)則，在菌落周?chē)纬扇樯恋頃炄Γ‥型較寬，AB型較窄），用斜視光觀察，菌落表面呈現(xiàn)珍珠樣彩虹，這種光澤區(qū)可隨蔓延生長(zhǎng)擴(kuò)散到不規(guī)則邊緣區(qū)外的暈圈。

5.3.2.4  菌株純化培養(yǎng)，在分離培養(yǎng)平板上選擇5個(gè)肉毒梭菌可疑菌落，分別接種卵黃瓊脂平板，35℃±1℃，厭氧培養(yǎng)48h，按5.3.2.3觀察菌落形態(tài)及其純度。

5.3.3   鑒定試驗(yàn)

5.3.3.1  染色鏡檢

挑取可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色和鏡檢，肉毒梭菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽(yáng)性粗大桿菌、芽胞卵圓形、大于菌體、位于次端，菌體呈網(wǎng)球拍狀。

5.3.3.2  毒素基因檢測(cè)（PCR快速鑒定）

a）菌株活化：挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種TPGY，35℃±1℃厭氧培養(yǎng)24h。

b）DNA模板制備：吸取TPGY培養(yǎng)液1.4mL至無(wú)菌離心管中， 14000g離心２min，棄上清，加入1.0mLPBS懸浮菌體，14000g離心２min，棄上清，用400µL PBS重懸沉淀，加入10mg/mL*溶液100µL，搖勻，37℃水浴15min，加入10mg/mL蛋白酶K溶液10µL，搖勻，60℃水浴1h，再沸水浴10min，14000g離心２min，上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌小離心管中，加入3mol/LNaAc溶液50µL和95%乙醇1.0mL，搖勻，-70℃或-20℃放置30min，14000g離心10min，棄去上清液，沉淀干燥后溶于200µLTE緩沖液，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，也可采用常規(guī)水煮沸法或商品化試劑盒制備DNA模板。

c）核酸濃度測(cè)定（必要時(shí)）：取5µLDNA模板溶液，加超純水稀釋至1mL，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm波段的吸光值A(chǔ)260和A280。按式（1）計(jì)算DNA濃度。當(dāng)濃度在0.34µg/mL～340µg/mL或A260/A280比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。

C= A260×N×50                     ………………………(1)

式中：

C—DNA濃度，單位為µg/mL；

A260—260nm處的吸光值；

N—核酸稀釋倍數(shù)。

d）PCR擴(kuò)增

1）采用分別針對(duì)Ａ型、Ｂ型、Ｅ型和Ｆ型肉毒梭菌毒素基因設(shè)計(jì)的特異性引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)PCR反應(yīng)管檢測(cè)一種型別的肉毒梭菌。

2）反應(yīng)體系配制見(jiàn)表2，反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

3）反應(yīng)程序，預(yù)變性95℃、５min；循環(huán)參數(shù)94℃、１min，60℃、１min，72℃、１min；循環(huán)數(shù)40；后延伸72℃，10min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4）PCR擴(kuò)增體系應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉毒毒素基因的質(zhì)控品作陽(yáng)性對(duì)照、非肉毒梭菌基因組DNA作陰性對(duì)照、無(wú)菌水作空白對(duì)照。

e）凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用0.5×TBE緩沖液配制1.2～1.5的瓊脂糖凝膠，凝膠加熱融化后冷卻至60℃左右加入溴化乙錠至0.5µg/mL或Goldview5µL/100mL制備膠塊，取10µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.0µL6×加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣，其中一孔加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。0.5×TBE電泳緩沖液，10V/cm恒壓電泳，根據(jù)溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置確定電泳時(shí)間，用紫外檢測(cè)儀或凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物也可采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測(cè)。

f）結(jié)果判定，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶（表1），判定本次PCR檢測(cè)成立；待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判定為PCR結(jié)果陽(yáng)性，根據(jù)表1判定肉毒梭菌菌株型別，待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判定PCR結(jié)果為陰性。

5.3.3.3  菌株產(chǎn)毒試驗(yàn)

將PCR陽(yáng)性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接種庖肉培養(yǎng)基或TPGYT肉湯（用于E型肉毒梭菌），按5.3.1.2條件厭氧培養(yǎng)5d，按5.2方法進(jìn)行毒素檢測(cè)和（或）定型試驗(yàn)，毒素確證試驗(yàn)陽(yáng)性者，判定為肉毒梭菌，根據(jù)定型試驗(yàn)結(jié)果判定肉毒梭菌型別。

注：根據(jù)PCR陽(yáng)性菌株型別，可直接用相應(yīng)型別的肉毒毒素診斷血清進(jìn)行確證試驗(yàn)。

6  結(jié)果報(bào)告

6.1  肉毒毒素檢測(cè)結(jié)果報(bào)告

根據(jù)5.2.3確證試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g(mL)樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。

根據(jù)5.2.5定型試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告25g(mL)樣品中檢出某型肉毒毒素。

6.2  肉毒梭菌檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

根據(jù)5.3.3.2 PCR檢測(cè)結(jié)果陰性，報(bào)告樣品中未檢出肉毒梭菌。

根據(jù)5.3.3.3菌株產(chǎn)毒試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告樣品中檢出肉毒梭菌或某型肉毒梭菌或未檢出肉毒梭菌。