方法一：基準(zhǔn)法—6.5℃，培養(yǎng)10天（仲裁法）（IDF標(biāo)準(zhǔn)101A：1991）

1 適用范圍：適用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗(yàn)。

2 方法提要

2.1 準(zhǔn)備好倒有培養(yǎng)基和定量稀釋適當(dāng)倍數(shù)的被測樣品的培養(yǎng)皿。。

2.2 將培養(yǎng)皿在6.5℃條件下培養(yǎng)10天。

2.3 根據(jù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)計(jì)算出每毫升樣品中的菌落數(shù)，選擇菌落數(shù)比較恰當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)比較得當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

3試劑

3.1 稀釋液

生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液，滅菌。

3.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂23.5g+脫脂奶粉1g，溶于1000mL水中。必要時(shí)用濾紙過濾。調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150mL。在121±1℃下滅菌15min，如果培養(yǎng)基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1℃。如果不是，則為了不耽誤培養(yǎng)基的使用，在實(shí)驗(yàn)開始前，將培養(yǎng)基放入沸騰水浴中使其*熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1℃。

注：其中脫脂粉應(yīng)該不含有抑菌劑。

4 儀器及玻璃器皿

微生物實(shí)驗(yàn)室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：

4.1 培養(yǎng)箱，可以調(diào)節(jié)并保持到6.5±0.5℃

4.2 pH計(jì)，帶溫度補(bǔ)償，精度為0.1

4.3 水浴，可以保持到46±1℃

4.4 三角瓶，250—300mL，帶合適的塞子。

4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。

4.6 培養(yǎng)皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm

5.操作步驟

5.1樣品的稀釋及培養(yǎng)

5.1.1 以無菌操作，將25mL樣品注入含有225mL滅菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，充分混勻，制成1：10的稀釋液。

5.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分混勻，制成1：100的稀釋液。

5.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支吸管。

5.1.4 根據(jù)對樣品污染情況的估計(jì)，選擇2—3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。

注：其他稀釋方法可以使用，例如*步稀釋可以是10mL檢測樣品注入到90mL稀釋液中，或11mL檢測樣品注入到99mL稀釋液中。當(dāng)樣品和稀釋液用量更大，方法的精密度和準(zhǔn)確度就更高。

5.1.5稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46℃的培養(yǎng)基（可放置于46±1℃水浴保溫）注入平皿約15mL，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時(shí)將培養(yǎng)基傾入空的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

注：從稀釋樣品到傾倒培養(yǎng)基，整個(gè)操作過程不應(yīng)超過15min。

5.1.6 待培養(yǎng)基凝固，翻轉(zhuǎn)平板，放入6.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天。

注：每疊皿不應(yīng)超過6個(gè)，每疊皿之間以及與培養(yǎng)箱的壁之間應(yīng)保持一定的間隙。

5.2 菌落計(jì)數(shù)方法

對平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)在柔和的光線下計(jì)數(shù)。為了便于計(jì)數(shù)，可使用適當(dāng)?shù)姆糯箸R和（或）菌落計(jì)數(shù)器。以防極小的菌落遺漏，以及避免將平皿中雜質(zhì)顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。仔細(xì)檢查可疑的物質(zhì)，如需要可使用更高倍數(shù)的放大鏡，以區(qū)別菌落和外來物質(zhì)。

5.3 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告

5.3.1 平板菌落數(shù)的選擇

平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)若有鏈狀菌落生長時(shí)（菌落之間無明顯界限），若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。

5.3.2 稀釋度的選擇及報(bào)告

5.3.2.1 選取菌落數(shù)在10-300之間的培養(yǎng)皿作為計(jì)數(shù)的測定標(biāo)準(zhǔn)。

5.3.2.2 若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)在10-300之間，則按下面的方法計(jì)數(shù)。

計(jì)算每mL牛奶中微生物的個(gè)數(shù)N，用以下的公式：

∑c

                 N = 

（n1+0.1n2）d

這里∑c： 是所有皿上菌落數(shù)的總和。

n1： 是*個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)。

n2： 是第二個(gè)稀釋度培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)。

d： 是與*個(gè)稀釋液相對應(yīng)的稀釋因子

結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，后面的數(shù)字以四舍五入計(jì)算。當(dāng)?shù)谌粩?shù)是5時(shí)，看其左邊的數(shù)是奇偶數(shù)進(jìn)行數(shù)字取舍；如28500進(jìn)行數(shù)字取舍為28000，11500為12000。

結(jié)果以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示。

舉例

微生物計(jì)數(shù)給出以下的結(jié)果（包括兩個(gè)帶蓋培養(yǎng)皿）：

在*個(gè)稀釋度（10E-2）：168和215個(gè)菌

在第二個(gè)稀釋度（10E-3）：14和25個(gè)菌落

∑c 168+215+14+25 422

     N =  = = =19182

（n1+0.1n2）d [2+（0.1*2）]*10-2 0.022

根據(jù)上面所說結(jié)果進(jìn)行取舍為19000，結(jié)果為1.9×104個(gè)/ml。

注：如果有兩個(gè)以上可以計(jì)數(shù)的稀釋度，公式應(yīng)修改為用多個(gè)稀釋度進(jìn)行計(jì)算。如為三個(gè)稀釋度，由下面的公式可計(jì)算出每毫升中微生物的數(shù)量。

∑c

                   N = 

（n1+0.1n2+0.01n3）d

5.3.2.3 如果菌落數(shù)均小于10，則按稀釋度zui低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每毫升牛奶菌落的估計(jì)數(shù)。

5.3.2.4 如果菌落數(shù)均超過300，則按稀釋度zui高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每毫升牛奶菌落的估計(jì)數(shù)。

方法二：快速法—21℃，培養(yǎng)25ｈ（IDF標(biāo)準(zhǔn)132A）

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)描述的是通過21℃時(shí)快速菌落計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行嗜冷菌菌數(shù)估算的方法。

此方法用于原奶和巴氏殺菌奶的檢驗(yàn)—當(dāng)需要很快的得到嗜冷菌估算值的時(shí)候。

2 方法提要

2.1 準(zhǔn)備好倒有培養(yǎng)基和定量稀釋適當(dāng)倍數(shù)的被測樣品的培養(yǎng)皿。

2.2 將培養(yǎng)皿在21℃條件下培養(yǎng)25h。

2.3 根據(jù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)計(jì)算出每毫升樣品中的菌落數(shù)，選擇菌落數(shù)比較恰當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)比較得當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

3 試劑

3.1 稀釋液

生理鹽水：0.85％的氯化鈉水溶液，滅菌。

3.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂23.5g+脫脂奶粉1g，溶于1000mL水中。必要時(shí)用濾紙過濾。調(diào)節(jié)pH值為6.9±0.1。將培養(yǎng)基分裝倒入三角瓶中，每瓶100—150mL。在121±1℃下滅菌15min，如果培養(yǎng)基馬上要用，用水浴鍋冷卻到46±1℃。如果不是，則為了不耽誤培養(yǎng)基的使用，在實(shí)驗(yàn)開始前，將培養(yǎng)基放入沸騰水浴中使其*熔化，然后再放入水浴中冷卻到46±1℃。

注：其中脫脂粉應(yīng)該不含有抑菌劑。

4 儀器及玻璃器皿

微生物實(shí)驗(yàn)室常用儀器，制備和稀釋樣品所用儀器以及：

4.1 培養(yǎng)箱，可以調(diào)節(jié)并保持到21±1℃

4.2 pH計(jì)，帶溫度補(bǔ)償，精度為0.1

4.3 水浴，可以保持到46±1℃

4.4 三角瓶，250—300mL，帶合適的塞子。

4.5 吸管，用嘴吸的吸管要用脫脂棉或纖維素塞緊。

4.6培養(yǎng)皿，玻璃或塑料的，直徑在90—100mm

5. 操作步驟

5.1樣品的稀釋及培養(yǎng)

稀釋步驟同方法一中5.1.1—5.1.5。

5.1.6待培養(yǎng)基凝固翻轉(zhuǎn)平板，放入21℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)25h。

注：每疊皿不應(yīng)超過6個(gè)，每疊皿之間以及與培養(yǎng)箱的壁應(yīng)保持一定的間隙。

5.2菌落計(jì)數(shù)方法

同方法一中5.2。 

5.3 菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告

同方法一中5.3。