小鼠胱天蛋白酶9（Caspase-9）ELISA試劑盒說明書

小鼠胱天蛋白酶9（Caspase-9）ELISA試劑盒僅供研究使用

預期應用:ELISA法定量測定小鼠血漿、細胞培養物上清或其它相關液體中Caspase-9含量。

實驗原理:本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中Caspase-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Caspase-9抗原、化的抗小鼠Caspase-9抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Caspase-9呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 

特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠Caspase-9，且與其它相關蛋白無交叉反應。

組成:

1. 酶聯板：一塊（96孔） 

2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為1000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1000 pg/mL，500 pg/mL ，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL，15.6 pg/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內配制。

3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。

7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 

9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標本的采集及保存 :

1.血漿：用32％1：9（如：0.5mL 32％+4.5mL全血）抗凝，血液和抗凝劑須充分混均，使終濃度為3.2%。血漿標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

2.細胞培養物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟:

各試劑在使用前平衡至室溫。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 

4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。

6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 

注：

1.每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。 

2.為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。

洗板方法:

1.自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。

計算: 以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 

注意事項:

1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2． 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，使用排槍加樣。

3． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4． 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

說明 

1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。

2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。

3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準。

4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

5. 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。 

6. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

7. 所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

8. 有效期：6個月