梅毒螺旋體的檢測方法及評價

梅毒螺旋體（treponemapallidum,TP）是引起性傳播性疾病梅毒的主要病原體。1905年由Schandim等發現,通過人類粘膜或有破損的皮膚直接接觸病人感染性病灶而傳播。不但引起人類全身性疾病危害人們的健康,同時還傳播給下一代。多年來通過大量的研究工作,建立了許多檢測TP的方法。近年來,隨著分子生物學和免疫學技術的發展,進一步促進了對TP的研究工作,使得快速、敏感、特異的梅毒診斷方法不斷更新完善,有利于廣泛開展流行病學調查、預防控制及更準確地指導臨床治療。
TP檢測的各種方法
檢測TP和抗-TP抗體的方法有梅毒螺旋體檢查和血清學檢查法。梅毒螺旋體檢查主要包括暗視野顯微鏡檢查、直接免疫熒光實驗（ＤＦＡ）及梅毒螺旋體鍍銀染色檢查,其中ＤＦＡ的特異性較高。梅毒螺旋體檢查適用于一、二期梅毒有病損者的患者，受取材及特殊顯微鏡限制，耗時長,難以為臨床所接受。
血清學試驗是目前國內外診斷梅毒的主要方法,其種類較多,包括非螺旋體抗原試驗（非特異性試驗）和螺旋體抗原試驗（特異性試驗）。
非特異性試驗是以類脂質為抗原的試驗方法,世界衛生組織確認診斷梅毒的標準試驗有
1性病研究實驗室（VDRL）試驗;
2不加熱血清反應素（USR）實驗;
3快速血漿反應素（RPR）試驗;
4自動反應素（ART）試驗;
5 RST反應素篩選試驗和TRUSAT（甲苯胺紅不加熱血清試驗）。這些試驗因具有相同的標準化抗原,敏感性相似,對1、2期梅毒有診斷價值,也可做療效隨訪用。又因其操作簡易,費用低廉,常用作梅毒的篩選檢查。但它們的敏感性和特異性比特異試驗差,并且生物學假陽性高,結果受多種條件的影響。除對其他螺旋體感染時出現陽性外,假陽性還出現在急、慢性感染,妊娠,高丙種球蛋白血癥,結締組織病,溶血性貧血和其他自身免疫性疾病,也可出現在老年人和一些健康人,但多數情況下查不出原因。在國外上述幾種非特異性試驗中,除VDRL試驗常用外,RPR試驗和ART應用較少。
在我國多用RPR和TRUST。就TRUST、RPR兩種方法而言,對非特異性反應素抗體導致的陽性標本TRUST法的檢出率和重復性都強于RPR法,這可能與TRUST試劑中表面包裹抗原的甲苯胺紅顆粒比RPR試劑中的活性炭顆粒小更易耐受振蕩導致TRUST試劑穩定性強有關。
特異性試驗是以梅毒密螺旋體本身或非致病的密螺旋體為抗原,以檢查病人血清中抗密螺旋體的特異性抗體。目前應用的方法有:
1密螺旋體熒光抗體吸收（FTA-ABS）試驗; FTA-ABS試驗被認為是當前敏感性和特異性zui高的試驗方法, 且在1期梅毒頭幾天就可以測出特異性抗體F3G，常用來zui后確診梅毒,在研究中以它為標準。但提取物為活菌，存在潛在危險性，故其應用受到很大限制。FAT-ABS試驗是定性試驗,治療對它的影響也很小,一般用于確診而不用于篩選。
2梅毒密螺旋體血凝（TPHA）試驗; TPHA試驗容易操作和定量,特異性高,但試劑昂貴和不易標準化,偶然發生生物學假陽性。
通過對國內文獻回顧發現，近年來TPHA已成為對除FTA-ABS以外的其他實驗的“金標準”。
3蛋白印跡試驗; 免疫印跡法檢測梅毒特異性抗體敏感度等于或高于其它三種同類方法,特異性與ELISA和TPPA兩種方法相同,但顯著高于FTA-ABS法（92.2%）。免疫印跡法敏感度高,特異性好,操作簡單,不需特殊儀器設備,陰陽性結果界線分明,易于判斷,適應于臨床廣泛開展。
蛋白印跡試驗結合了免疫學和分子生物學的特點,敏感性高,特異性強。
梅毒螺旋體的檢測方法及評價
4 酶聯免疫吸附（ELISA）試驗; ELISA法采用抗原包被,用過氧化物酶標記并進行酶反應,是一種較新的梅毒診斷血清學方法。用抗梅毒特異性抗體ELISA試劑盒檢測梅毒抗體,*代試劑原理為間接法,采用梅毒抗原包被在酶標板上, 以辣根過氧化酶標記物的抗人-IgG為第二抗體,測定梅毒感染的特異性抗體,據報道ELISA法對梅毒感染的整體敏感性達98%以上,特異性達99%,可與TPHA,FTA-ABS試驗媲美。但梅毒患者血清存在IgG、IgM 二種抗體，應同時檢測，以提高敏感度。國外有報道：ELISA IgG敏感性一期梅毒為82%，其余各階段均為100%，假陽性1.5%；               ELISA IgM陽性率一期梅毒為 94%，二期梅毒為85%，早期潛伏梅毒為82%。因此認為分別作ELISA IgM和ELISA IgG是確診梅毒的一種有效而簡單的方法。國內有人同時檢測特異性IgG和IgM抗體，其陽性率分別為一期梅毒93.8%，二期梅毒100%（IgG/IgM抗體試劑由意大利公司提供）。
第二代抗TP-ELISA試劑使用雙抗體夾心法，主要是用基因重組表達抗原,包括梅毒螺旋體4種膜抗原,然后進行混合使用。用ELISA方法檢測,實驗結果與TPHA的總符合率為99 3%,且此方法操作簡便,一次可完成多份標本的檢測,試驗結果由儀器分析,客觀而準確。
現在的梅毒抗體診斷試劑將各區優勢抗原連接成一個多表位的嵌合抗原,這樣表達的多表位抗原即可滿足診斷試劑的需要,大大提高了檢測試劑的靈敏度。隨著抗原表位的增多,檢測的靈敏度也隨之提高。以Ｔｐ15 17 42 47的四合一重組抗原為基礎的診斷試劑是用于抗Ｔｐ ＥＬＩＳＡ的多表位抗原。
但有的TP-ELISA試劑,該試劑盒質量差，有文獻報道蘭州生物制品研究所的梅毒螺旋體特異性抗體酶標目測試劑盒與TPHA對比試驗,二者符合率45.5%,35例梅毒血清中僅6例呈TP-ELISA陽性,其陽性檢出率為17.1%。此6例TP-ELISA陽性者的TPHA結果,滴度均在1∶160以上,而TPHA1∶80陽性者無一例TP-ELISA陽性。敏感性極差。
有研究表明:用免疫印跡法、熒光梅毒螺旋體抗體吸附實驗（FTA-ABS）、酶聯免疫吸附實驗（ELISA）和梅毒螺旋體被動明膠顆粒凝集實驗（TPPA） 四種方法結果相比較。結果44例未經治療的梅四種方法檢測治療前后梅毒患者結果一致性分別為100%和92.8%,四種方法檢測梅毒的敏感度分別為100%,98.3%,98.3%,100%,經卡方檢驗,四種方法檢測敏感度差異無顯著性意義（P>0.05）。
5聚合酶鏈反應（PCR）試驗。
PCR法是目前的檢驗技術之一,直接檢測TP的DNA物質,敏感特異,但PCR方法在普通實驗室操作中容易造成PCR污染,且僅用于檢測病原,故并不能取代梅毒血清學檢測方法。
6膠體金免疫層析法（GICA）、金標免疫斑點法（DIFA）。
使用膠體金作為標記物的一種固相膜免疫測定方法,檢測梅毒特異性抗體,采用了雙抗夾心法。二期梅毒、三期梅毒、晚期潛伏梅毒的陽性試驗符合率為100%,在一期梅毒中的敏感度為80%～85%,對早期梅毒的敏感性均較差。 各檢測方法在臨床上的使用
TP檢驗方法的應用由于目前已獲得特異性抗原的基因工程重組蛋白的純制品,使得當前對梅毒的診斷仍能以血清學試驗為可靠的依據,但因試用于臨床診斷時間尚短,仍應結合病史和全面地體格檢查,而做出診斷。
篩選應用　一般認為感染梅毒后可檢出陽性結果的試驗順序通常是FTA-ABS試驗→非特異性試驗→TPHA試驗,但在以早期診斷為目的情況下,可以幾種方法同時進行,常用的是一種或兩種非特異性試驗和一種特異性試驗聯合檢查,一般選用VDRL和RPR試驗與TPHA試驗配合應用。
證實試驗應用　使用FTA-ABS試驗。由于血凝法技術的進展,如MHA-TP試驗也可用于確診,但其敏感性介于非特異性試驗和FTA-ABS試驗之間。
ELISA也有可作為梅毒的確診試驗。觀察病情和治療反應的作用　早期梅毒經治療后,非特異性的反應素滴度一般下降很快,特異性試驗中FTA-ABS試驗的陽性反應（不能觀察滴度的變化）可保留一段時間
而在TPHA試驗雖然病人經過充分治療并顯示臨床上的成功,但試驗的陽性反應仍能持續相當長時間,甚至終身陽性。
免疫印跡技術和PCR診斷有癥狀的先天性梅毒時,具有高度敏感性和特異性,但對無癥狀的嬰兒診斷時需慎重,應考慮存在非特異性的抗體反應。PCR可取代RST作為診斷先天性及神經性梅毒常用方法。
綜上所述，對血清學試驗選擇，應選用TPHA、TPPA法進行過篩試驗，陽性者用PST-ABS等法作確認試驗。RPR、TRUST可將標本進行稀釋進行半定量試驗，可以作為療效評價及判斷是否再次感染試驗。。ELISAS應作IgG、IgM抗體檢測以提高敏感度。ICKD、                          LCMD 法假陰、陽性多，但方法簡單、快速，可作為普查用。
梅毒診斷一度僅依賴于暗視野顯微鏡檢查和敏感性、特異性均低的一般血清學試驗。隨著分子生物學技術發展,聚合酶鏈反應和免疫印跡技術為梅毒的診斷提供了新的檢測手段。特別是在早期梅毒、先天性及神經性梅毒診斷中顯示了較高的敏感性和較強的特異性。梅毒診斷方法的發展和完善,有利于指導臨床及時治療。