一、辣根過氧化物酶HRP

HRPzui常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（雜環(huán)吖嗪）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4—氨基*：*耦聯(lián)底物對(duì)等。上述色原底物受HRP作用主要有兩種形式的反應(yīng)：①氧化還原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一個(gè)氨基芳香劑與另一個(gè)芳香基化合物的氧化耦聯(lián)，如4—氨基*：*等。

1、氧化還原色原底物

OPD被認(rèn)為是HRPzui為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫（H202）氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5.0左右時(shí)，DAB在波長(zhǎng)450nm處有廣范圍的zui大吸收，當(dāng)pH值降為1.0時(shí)，zui大吸收波長(zhǎng)移動(dòng)至492nm，同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深（圖4—2）。因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。實(shí)際工作中，用強(qiáng)酸尤其是鹽酸終止反應(yīng)后，顯色并不穩(wěn)定，常隨時(shí)間增長(zhǎng)而顏色加深，這是由于反應(yīng)后剩余的過氧化氫繼續(xù)氧化OPD而產(chǎn)生非酶催化的DAB的結(jié)果。有人在強(qiáng)酸反應(yīng)終止液中加入還原劑如亞硫酸鈉，因還原劑可迅速*地將剩余的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化，結(jié)果顯色穩(wěn)定，數(shù)十小時(shí)內(nèi)不變，而且無需避光。OPD的缺點(diǎn)是其對(duì)機(jī)體具有致突變作用。由于OPD的不穩(wěn)定性，現(xiàn)在的商品試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應(yīng)，臨用時(shí)再溶解于相應(yīng)的緩沖液。

在ELISA測(cè)定時(shí)，OPD色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：在0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH5.0）中含20 mmol/L OPD和12 mmol/L H202，或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H202；②終止液：2 mol/L硫酸（含0.1 mol/L亞硫酸鈉）；③測(cè)定波長(zhǎng)：492nm。

TMB是一種優(yōu)于OPD的新型HRP色原底物。其氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有zui大消光系數(shù)，如果HRP量少，*和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH，即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌（圖4—3）。使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min，但隨后本底顯色就不斷加深，國(guó)內(nèi)有人認(rèn)為使用1％SDS作為終止劑，可使鮮藍(lán)色24h內(nèi)保持不變，陰陽性對(duì)比十分明顯，但在我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)1％SDS對(duì)上述顯色有較強(qiáng)的褪色作用，目前仍以硫酸作為終止劑較為理想。ELISA中，底物反應(yīng)顯色后，常選擇其具zui大吸收的波長(zhǎng)450nm比色測(cè)定結(jié)果。而’Madersbacher和Berger等為提高以TMB作底物的ELISA測(cè)定的敏感性，選擇顯色呈指數(shù)加深時(shí)的波長(zhǎng)405nm比色測(cè)定。他們首先測(cè)定一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在450nm和405nm的值，證實(shí)A450nm/A405nm之比為3.2，然后在使用波長(zhǎng)405nm測(cè)定含低濃度待測(cè)物的標(biāo)本得到的OD值再乘以常數(shù)3.2，即為待測(cè)標(biāo)本在波長(zhǎng)450nm處的真值。該種雙波長(zhǎng)測(cè)定方法可使ELISA測(cè)定范圍提高3倍。TMB的顯色反應(yīng)雖與OPD一樣同屬氧化還原反應(yīng)，但前者的反應(yīng)是可逆的，如終止液中存在還原劑（*及亞硫酸鈉、SDS等），則可反應(yīng)顯色迅速消退。TMB雖然溶解度相對(duì)較低，但由于其高檢測(cè)敏感性及無致突變作用，現(xiàn)已基本上取代了OPD而成為HRPzui為常的色原底物。

在商品ELISA試劑盒尤其是國(guó)內(nèi)的產(chǎn)品中，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態(tài)試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液，一種為TMB溶液，鑒于過氧化氫、TMB在溶液中相對(duì)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此，我們?cè)谑褂肊LISA試劑盒時(shí)，如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B出現(xiàn)顏色，或二者各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄。

在ELISA測(cè)定時(shí)，TMB色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0.1 mol/L的濃度溶于二甲亞砜，然后，再將其以1 mmol/L和H202以3.0 mmol/L的濃度溶于0.2mol/L醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液（pH4.0），即可應(yīng)用。②終止液：2 mol/L硫酸。③測(cè)定波長(zhǎng)：450nm。

ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橐装l(fā)生歧化的陽離子根（圖4—4）。陽離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產(chǎn)物相比更適于可見光測(cè)定（測(cè)定波長(zhǎng)入＝414nm）。上述顯色也不穩(wěn)定，10 mmol/L疊氮鈉是較為理想的終止劑，可使顯色穩(wěn)定數(shù)十小時(shí)，且可減少陽離子根的歧化。另有人報(bào)道用1.25％NaF終止反應(yīng)效果較好。

ABTS在目前國(guó)內(nèi)的ELISA試劑盒中基本上沒有應(yīng)用，但在國(guó)外ELISA試劑盒偶見有應(yīng)用。

在ELISA測(cè)定時(shí)，ABTS色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol/L和H202以2.5 mmo!/L的濃度溶于0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 4.2），即可應(yīng)用；②終止液：10 mmol/L疊氮鈉；③測(cè)定波長(zhǎng)；414nm或405nm。

除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等。

2、氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)

HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)主要有4—氨基*：*耦聯(lián)底物對(duì)（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯(lián)底物對(duì)（Ngo—Lenhoff試劑）等。

在H202存在下，4—氨基*和*經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收（圖4—5）。

該耦聯(lián)色原底物對(duì)用于固相ELISA時(shí)，敏感性一般較低，反應(yīng)見光不穩(wěn)定，而且*易發(fā)生多聚化，缺乏適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)終止劑。因此，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標(biāo)的酶法檢測(cè)應(yīng)用。1989年日本學(xué)者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標(biāo)記酶的均相酶免疫試驗(yàn)，可用甲醛終止反應(yīng)。但這種方法僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，其后也未見有其他實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用報(bào)道，可能還有其固有的缺陷。

4—氨基*：*耦聯(lián)底物對(duì)色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基*以2 mmol/L，*以25 mmol/L和H202以0.8 mmol/L的濃度溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2），即可應(yīng)用；②終止液：未見報(bào)道；③測(cè)定波長(zhǎng)：492nm。

MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍(lán)色的吲達(dá)胺（indamine），zui大吸收波長(zhǎng)為590nm，見光不穩(wěn)定。用鹽酸或硫酸終止反應(yīng)后，pH應(yīng)為3.0左右，pH值的降低使顯色從紫藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{(lán)色，zui大吸收波長(zhǎng)從590nm變?yōu)?95nm，然而pH值的進(jìn)一步降低，將導(dǎo)致光吸收消失。

MBTH：DMA耦聯(lián)對(duì)在固相ELISA測(cè)定幾乎沒有應(yīng)用。

二、堿性磷酸酶（AP）

在ELISA測(cè)定中，堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對(duì)硝基苯磷酸鹽（p-nitropheny—phosate，pNPP）。pNPP在堿性磷酸酶的作用下生成對(duì)硝基酚（pNP），其在入＝405 nm處有zui大吸收.

由于堿性條件下pNP的光吸收增強(qiáng)，并可使堿性磷酸酶失活，因而可使用碳酸鈉作為終止劑。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺，因?yàn)閱我掖及穼?duì)堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用。較高濃度的無機(jī)磷可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制堿性磷酸酶的活性，pNPP貯存時(shí)間過長(zhǎng)由于非酶水解而產(chǎn)生硝基酚和磷酸鹽時(shí)即可出現(xiàn)這種情況，此時(shí)pNPP呈黃色。

因此，用于ELISA測(cè)定時(shí)，pNPP必須五色。pNP的摩爾消光系數(shù)（光吸收）的變化取決于溶液的pH及溫度、離子強(qiáng)度、蛋白含量，當(dāng)溫度從15~C升高至45℃時(shí)，pNP在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。

在ELISA測(cè)定時(shí)，pNPP色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將pNPP以10 mmol/L的濃度溶于含1 mmol/LMgCl：的0.1 mol/L二乙醇胺緩沖液（pH 9.8），即可應(yīng)用；②終止液：0.5 mol/L碳酸鈉；③測(cè)定波長(zhǎng)：405nm。