人（Human）白介素4（IL-4）ELISA

檢測試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙蛋白兩步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預包被捕獲蛋白的透明微孔中，依次加入標準品、標本，溫育并洗滌后，再加入HRP標記的檢測蛋白，溫育并洗滌后，用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測蛋白濃度呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。

2.  標準品臨使用時再稀釋，稀釋后用剩的標準品應立刻丟棄，不可保存。

3.  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

4.  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

試劑的準備

1.  標準品：標準品（1600pg/mL）在實驗前用標準品稀釋液進行倍比稀釋，得到6個濃度點（包括標準品點）：1600、800、400、200、100、50pg/mL

2.  20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板4-5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板4-5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條密封放回4℃。

2.  除空白孔外，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加*40μL（即樣本稀釋5倍），用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

3.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

4.  除空白孔外，每孔加入檢測蛋白-HRP 50μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5.  重復步驟3的操作。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

1.  每個標準品和樣本的OD值應減去空白孔的OD值。

2.  繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值，再乘以稀釋倍數，即為樣本濃度。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于6號標準品。

3.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個月

免責聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2.   嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。

FOR RESEARCH USE ONLY.

NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

Human Interleukin 4 （IL-4） ELISA Kit instruction

Intended use

This IL-4 ELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from blue to yellow and the intensity of the color is measured at 450 nm using a spectrophotometer. In order to measure the concentration of IL-4 in the sample, this IL-4 ELISA Kit includes a set of calibration standards. The calibration standards are assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a standard curve of Optical Density versus IL-4 concentration. The concentration of IL-4 in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.

Sample collection and storages

Serum - Use a serum separator tube and allow samples to clot for 30 minutes before centrifugation for 10 minutes at approximay 3000×g. Remove serum and assay immediay or aliquot and store samples at -20℃ or -80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles

Plasma - Collect plasma using EDTA or heparin as an anticoagulant. Centrifuge samples for 30 minutes at 3000×g at 2-8℃ within 30 minutes of collection. Store samples at -20℃or -80℃. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Cell culture supernates and other biological fluids - Remove particulates by centrifugation and assay immediay or aliquot and store samples at -20℃or -80℃. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Note:  The samples shoule be centrifugated dequay and no hemolysis or granule was allowed.

Materials required but not supplied

1.  Standard microplate reader（450nm）

2.  Precision pipettes and Disposable pipette tips.

3.  37 ℃ incubator

Precautions

1.  Do not substitute reagents from one kit to another. Standard, conjugate and microplates are matched for optimal performance. Use only the reagents supplied by manufacturer.

2.  Do not remove microplate from the storage bag until needed. Unused strips should be stored at 2-8°C in their pouch with the desiccant provided.

3.  Mix all reagents before using.

Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature （ 20-25°C）

Materials supplied

Reagent preparation

1.         Standard:Dilute with Standard diluent to six point: 1600、800、400、200、100、50pg/mL.

2.  20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water 1:20.

Assay procedure

1.  Prepare all reagents before starting assay procedure. It is recommended that all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.

2.  Add standard and Sample: Set Standard wells, testing sample wells and blank wells. Add Diluted standard 50μl to standard well; Add Sample dilution 40μl to testing sample well which on Assay plate, then add testing sample 10μl （sample final dilute degree is 5 times）, blank well doesn’t add anyting. cover with an adhesive strip and incubate for 30 minutes at 37°C.

3.  Aspirate each well and wash, repeating the process four times for a total of five washes. Wash by filling each well with Wash Solution （400μl） using a squirt bottle, manifold dispenser or autowasher. Complete removal of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash, remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.

4.  Add 50μl of HRP-conjugate reagent, cover with an adhesive strip and incubate for 30 minutes at 37°C.

5.  Repeat step3.

6.  Add chromogen solution A 50μl and chromogen solution B 50μl to each well. Gently mix and incubate for 15 minutes at 37°C. Protect from light.

7.  Add 50μl Stop Solution to each well. The color in the wells should change from blue to yellow. If the color in the wells is green or the color change does not appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.Read the Optical Density （O.D.） at 450 nm using a microtiter plate reader within 15 minutes.