操作步驟

1）大腸桿菌感受態細胞的制備(CaCl₂法)

      (1) 從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于3～5ml LB液體培養中，37℃振蕩培養12h左右，直至對數生長期。將該菌懸液以1:100～1:50轉接于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔20～30min測一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時停止培養；
      (2) 每組取培養液3個2ml轉入2ml離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4℃，4000r／min離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進行，速度盡量快而穩）；
      (3) 倒凈上清培養液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液輕輕懸浮細胞，冰浴；
      (4) 0～4℃，4000r／min離心10min；
      (5) 棄去上清液，加入500µll冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心懸浮細胞。0～4℃，4000r／min離心10min；
      (6) 棄去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態細胞懸液；
      (7) 制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。

2）細胞轉化 

      (1) 分別取3個100µl感受態細胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作)，*組，加入10 µl重組質粒DNA(體積不超過10µl) 100µl感受態細胞，此管為轉化實驗組。第二組，插入DNa 片段對照組，即酶切后DNa 片段25ng 100µl感受態細胞懸液；第三組，質粒DNA對照組，即1ng 未酶切pBluescript 質粒DNA十100µl感受態細胞懸液。
      (2) 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min
      (3) 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉化反應原液，搖勻后于37℃振蕩培養約45-60min ，使受體菌恢復正常生長狀態，并使轉化體表達抗生素基因產物(Ampr)。

3) 平板培養（有時需要稀釋）

      (1) 取各樣品培養液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。
      (2) 菌液*被培養基吸收后，倒置培養皿，于37℃恒溫培養箱內培養過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養，對于可以藍白斑篩選的質粒和菌株來說，此時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。

用 CaCl₂法制備的感受態細胞，可使每微克超螺旋質粒  DNA產生5×10⁶-2×10⁷個轉化菌落。在實際工作中，每微克有10⁵以上的轉化菌落足以滿足一般的克隆實驗。

4) 檢出轉化體和計算轉化率
      統計每個培養皿中的菌落數，各實驗組培養皿內菌落生長狀況應如表所示：
      各實驗組在培養皿內菌落生長狀況及結果分析

      轉化體總數＝菌落數×（轉化反應原液總體積/涂板菌液體積）
              插入頻率＝藍色菌落數/白色菌落數
              轉化頻率＝轉化體總數/加入質粒DNA的量（計算出每微克的轉化菌落數）