2012年2月,FDA發布了期待已久的生物仿制藥指導文件草案[1-3],這三個文件概述了FDA在審批高相似性仿制藥時所考慮的必要程序和要求,嚴格對仿制藥進行類似特征的分析處于審批的核心位置,這一首要步驟表明仿制藥與參照藥高度的相似性.根據草案的指導,在仿制藥和創新藥之間進行更為廣泛、強大的結構與功能方面的對比分析,該結構特征決定了在審批時需要怎樣的臨床與非臨床研究. [1]
仿制藥指紋：生物分析法尋找其結構特征
尋找指紋
FDA指導草案的一個重要特征是識別一種蛋白質的“指紋”,通過相似性組合方法測量一系列結構屬性,進而確定仿制藥與藥之間的相似性.在某種程度上,這一概念源自于依諾肝素（抗凝血藥）獲得審批的經歷,在2010年7月這一低分子量的肝素在沒有臨床試驗的情況下獲得審批.根據五個標準,FDA認為其具有與Lovenox相似的活性成分[4],列舉如下：
• 依諾肝素的物、化特性
• 依諾肝素的性質和化學裂解過程
• 依諾肝素成分的性質和排布
• 實驗室測量的依諾肝素抗凝血活性
• 藥物對人類作用的某些效果
雖然依諾肝素不是一種蛋白質,但是它是一種復雜的生物產品,在理化水平上,它的特征更像重組蛋白產品.
指南草案表明,指紋信息會*蛋白質產品的基本信息（參見附文“蛋白質品質屬性”）.FDA表示,“這可能是有用的：通過使用指紋樣的分析算法（包括大量的附加屬性以及高靈敏性的組合）,研究人員在遞交的與參照的產品之間進行品質屬性的差異對比.[3]”FDA沒有定義這類蛋白質的特定屬性以及使用方法,從一方面看,這是因為蛋白質產品在特征上具有極大的多樣性.
Fiona M. Greer 稱：“指紋將取決于單個分子以及關鍵品質的相關屬性,這可能用于規范一類特定的分子,而不是一類產品.例如,糖對于一類分子的功效具有重要作用,而在另一類分子中可能不重要.標準屬性應該包括物理化學（初級和較的有序結構）和生物學的特性.毫無疑問,該整合信息對于轉錄后修飾是需要的.”
指紋對比技術需要不斷改進.盡管真實指紋具有*性和不變性,然而很難控制蛋白質的屬性.從蛋白產品來看,翻譯修飾后的改變對于蛋白質生物活性的重要作用具有不確定性,對于培養的細胞,蛋白質的異質特征是可預料的,而生物制品的審核過程涉及到與監管機構的討論：分段定義異質性以及不受影響的產品效力和安全性.
對于仿制藥制造商而言,關鍵的一環是識別蛋白質產品的變異程度,這一步驟涉及在不同時間段獲得的多批次產品和在多個方面評估其可行的上架期限,以及確定產品表現的一系列品質屬性.
馬薩諸塞州生物制造中心蛋白質科學部門主任Jin Xu說,“我不會建議挑選一個批次,并試圖制造相似性高達99%的蛋白質,這類比對蛋白質將表現出一系列可接受的理化性質,生物仿制藥也屬于這一范圍.”
翻譯后修飾
糖基化能夠解釋蛋白質較大的異質性,這取決于蛋白質糖基化的水平.糖單位連接到任一蛋白質的糖基化位點上,其取決于宿主細胞類型（來自于動物、植物和微生物）.針對這一原因,FDA建議使用同種類型的細胞生產生物仿制藥,然而,即使在同一種培養的單細胞中相同的肽鏈也會出現不同的糖鏈結構.
由于糖基化對于蛋白質的功效、穩定性或免疫原性可能具有重要作用,因此,它作為一個參數需要很好地定義和控制.zui起碼確定的是蛋白質中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖及唾液酸）、糖鏈結構、寡糖模式（支鏈剖面）以及多肽鏈的糖基化位點.
Pauline Rudd 稱：“聚糖在空間上具有多維度,研究人員可在一個水平上分析抗原表位,或進行詳細的分析,這取決于蛋白質的關鍵功能.FDA感興趣的是糖基化多樣性,它可能引起人體免疫原性.例如,植物源性蛋白中的木糖和巖藻糖.
Rudd解釋道,雖然聚糖表現出許多生物產品的關鍵功能,但是它們不是的.大約存在200個潛在的翻譯后修飾,包括C-末端剪切、二硫鍵的形成、糖基化和脫酰胺.二硫鍵在正確折疊蛋白質三維結構中發揮重要作用,但是半*殘基有時出現錯配,從而使得二硫鍵不正確地形成.他認為,研究人員需要越來越多的水平的結構分析（即三維結構分析）.
正交和重疊技術
當開發一個生物仿制藥,對理化性質的界定不僅要確定原創藥的完整序列和轉錄后修飾,還要評估產品的品質屬性和純度.原創藥和仿制藥之間側端的比較將需要來自不同技術的數據,它們用于反映兩種分子的主體結構和高度有序的結構.關于選取適當分析方法的指導方針可參考ICH Q6B[5].單一方法可提供多種蛋白質屬性的信息,例如,丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）可提供關于體積、聚集體以及二硫鍵變異體的信息,而等電聚焦能提供同種型的信息,后者可反映糖基化或脫酰胺的差異.
準確的特征策略取決于單個分子,同時還借助可比較分子大小、電荷以及結構的方法,其中質譜法（MS）是一種用處廣泛和重要的方法,其可提供關于完整分子量,結構確認（通過大規模的測繪技術）、異質性和翻譯后修飾（包括糖基化）的信息.
過程和產品
對于生物制劑,影響zui終產品的因素有很多,如合成蛋白質的細胞類型、細胞培養的特定條件、以及下游加工的方法.近來,細胞培養條件對糖基化影響的研究發現,幾乎所用的細胞培養條件都具有效果,包括細胞培養基的成分、溶解氧濃度、生物反應器pH值、二氧化碳分壓、溫度、剪切應力以及生產模式（即補料與灌注）[6] .規模擴大也可以影響產品的糖基化,在工藝開發和規模擴大時需要控制多項特征參數.首先確定糖基化屬性對于蛋白質功能起到至關重要的作用,然后選擇這些屬性*的檢測方法,而不是嘗試漫無目的方法以簡化流程[7].
比看起來的困難
雖然仿制藥可能比原創藥較容易,但是工程化生產特定仿制藥的難度不能被低估.Rudd指出,,生產原創藥要比簡單得將DNA插入到細胞系中要困難得多,研究人員期待原創藥能夠被忠實地復制.對于生物制劑,zui終產品與生物進程緊密相關,但是生物仿制藥制造商卻不知道原創藥的這些過程.
EMA是美國生物仿制藥的*,在2006年獲取*個批準的生物仿制藥,目前已有14個生物仿制藥投放到市場上.EMA發布指導文件以針對不同的產品類型（包括epoetins、filgastrims）,以及提供關于單克隆抗體的指導草案[8-10].此類產品的具體規格無疑能夠及時獲得FDA審批,并有助于更好地界定指紋的模型
