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Boyden盲端小室法檢測IL-8趨化活性

閱讀:819發布時間:2012-5-12

Boyden法比瓊脂糖法敏感,能檢測出納克(nz)水平的趨化因子活性,且需時間短、重復性好,現已被廣泛采用。
Boyden小室由上、下兩室組成,下室為一盲端,兩室間用一層硝酸纖維素膜分隔。當下室加入IL-8或待測因子,上室加入細胞時,因子在膜的兩側很快形成濃度梯度,細胞從上室低濃度處向著下室膜移動,根據遷移細胞的多少和細胞類型判斷趨化活性的強弱及性質。
(1)外周血粒細胞或單核細胞的制備:取肝素抗凝血5—10mL,經Ficoll—*密度梯度離心分離,得到單個核細胞、粒細胞和紅細胞沉淀,將粒細胞、紅細胞沉淀用低滲氯化銨處理溶解紅細胞,即得到粒細胞。
(2)用含5%NCS的DMEM培養液洗細胞2次,調整細胞濃度至2×106/mL備用。
(3)趨化試驗:在Boyden小室的下室分別加入陽性對照,陰性對照及待測因子樣品,每個濃度三個小室。
(4)蓋上硝酸纖維素膜,注意下室液體和硝酸纖維素膜之間不應有氣泡,上室、下室液體之間不應互相流通。
(5)蓋上上室,每一上室加入200/uL細胞懸液,注意加樣時應輕放加樣器,以防損壞硝酸纖維素膜。
(6)置37℃,5%C02條件下孵育2h,孵育過程不應移動小室,以防破壞梯度。
(7)去除上室細胞,將膜取出,甲醇短時固定,蘇木精染色,封片鏡檢。
(8)計算移動指數:高倍鏡下計數每張膜下細胞數,按下式求出移動指數
移動指數=實驗組細胞數/陰性對照組細胞數
(9)如所加細胞為?昆合細胞,可用另一種改進Boyden室,其上下室的容積分別為1.5mL,因此可將進入下室的細胞收集在試管中,分別進行熒光抗體染色,4~C,30min。然后加人第二抗體4~C,30min。詳細方法見IL-4檢測。
(10)流式細胞儀分析細胞表型,觀察檢測樣本所趨化的細胞類型。
根據所加細胞不同,選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜,粒細胞為3um孔徑膜,淋巴細胞為8/um孔徑膜。


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