一、目的及要求
1、了解質粒作為載體在基因工程中的作用
2、熟記提取質粒的基本原理，學習提取過程和方法
3、為下一步實驗提供高純度的DNA 樣品
二、原理
1、質粒（Plasmid）：獨立于染色體以外的雙鏈、閉合、環狀DNA，可自我復制。為基因工程中的常用載體（Vector）
2、作為載體的質粒需具備以下特點：
1） 能自主復制。
2） 具有多個限制性內切酶的單一酶切位點，又稱為多克隆位點（multiple cloning sites, MCS），便于外源基因的插入。
3） 具有1 個以上的篩選標記（抗性基因）。
4） 分子量相對較小，多拷貝。
5） 非結合性質粒。
6） 轉化效率高。
目前已有一系列符合上述要求的質粒作為商品供應。
3、大腸桿菌中提取純化質粒的主要步驟：
1） 細菌的培養：LB 培養基+氨芐*O.D600=0.4 對數生長期O.D600=0.6 對數生長后期
2）細菌的收集和裂解
收集：離心，STE 液洗1-2 次，去除代謝物
裂解：SDS 法、堿裂解法、煮沸法
堿裂解法：EDTA 破壞細菌的細胞壁和細胞外膜→SDS 裂解細胞膜→NaOH 使核酸、蛋白質變性。
3）質粒的分離和純化
加入酸液，質粒DNA、小分子RNA 復性（可溶），染色體DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白質/膜復合物沉淀，離心棄除；酚:氯仿抽提去除蛋白質；RNAse去除殘留小分子RNA。
三、試劑：
略
四、操作：
1．將0.2ml 含重組質粒pIL 的大腸桿菌接種于2.5ml LB 培養基（含Amp 100ug/ml）中，37℃、150rpm 振蕩培養過夜。作用：加Amp 的目的為使含Amp 抗性基因的細菌選擇性生長。
2．取1.5ml 菌液置于1.5ml EP 管中，15,000rpm 離心30 秒，棄上清，將培養液盡量控干。
作用：沉淀細菌。注意：控干時將吸水紙卷成圓柱狀，沿管壁輕輕吸取水珠。控干時不要觸及細菌沉淀。
3．加入1ml STE 溶液，漩渦振蕩器上振蕩懸菌，15,000rpm 離心5min，棄上清，控干。
作用：去除培養基中殘留的細菌代謝物。
4．加入100ul 溶液Ⅰ，震蕩懸菌，室溫放置5min。
作用：Glucose--增加溶液粘度，保護DNA；Tris-HCl--緩沖液；
EDTA--螯合二價陽離子，抑制核酸酶，預處理細菌。
注意：在渦振蕩器上震蕩懸菌。
5．加入200ul 溶液Ⅱ，輕輕顛倒混勻5 次，置冰浴5min。
作用：SDS--去污劑，使細胞裂解；NaOH--變性劑，使蛋白質、核酸變性。注意：此時溶液呈膠胨狀，嚴格控制混勻次數和變性時間。
6．加入150ul 溶液Ⅲ，顛倒混勻，置冰浴10min。
作用：酸液，中和NaOH，使質粒DNA、小分子RNA 復性（可溶），染色體DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋白質/膜復合物不能復性而沉淀
注意：此時溶液出現大量絮狀沉淀
7．15,000rpm 離心5min，將上清400ul 轉移至另一干凈EP 管中，棄沉淀。
注意：將槍頭插入溶液*吸取，不要將沉淀吸出，用吸水紙擦拭槍頭。
8．加入240ul 異丙醇（0.6 體積），混勻，置室溫10min。
作用：沉淀核酸（DNA、大分子rRNA、mRNA）和蛋白質。
9．15,000rpm 離心10min，棄上清，控干。
10．50ul TE 溶解沉淀，加入50ul 冰預冷的5M LiCl，混勻，置冰浴10min。
作用：使大分子大分子rRNA、mRNA 沉淀，而DNA 不沉淀。
11．15,000rpm 離心10min，上清100ul 轉移至另一EP 管中。
12．加2 倍體積-20℃預冷的無水乙醇，混勻，-20℃沉淀10min。
13．15,000rpm 離心10min，棄上清。
14．待乙醇揮發后，將沉淀溶于20ul TE。將質粒DNA 溶液置于-20℃保存。
五、注意事項：
1．嚴格控制堿變性的時間時間，不超過5 分鐘。因為，如質粒處于強堿性環境中時間過長，可發生不可逆變性，導致限制性內切酶切割困難。
2．在加入溶液III 后，要充分混勻并置冰上。如未見大量白色沉淀，說明實驗失敗，應立即重做。
3．棄上清時，必須控干即除盡管內的液體，在做zui后一步時，應盡量將乙醇揮發干凈，因為如殘留較多乙醇，以后在做酶切鑒定時，乙醇會使限制性內切酶失活。但此步的時間不宜過長，一般在10-15 分鐘左右，可用濾紙條小心吸凈離心管壁上的乙醇液滴以節省時間。
