多聚甲醛固定后的效應(yīng)細(xì)胞或直接用效應(yīng)細(xì)胞的胞膜（其膜表面有跨膜型TNF-a），按一定比例加入靶細(xì)胞，如L929，以觀察跨膜型TNF-a對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
1．材料 ①L929細(xì)胞株；②1％多聚甲醛溶于RPMI-1640培養(yǎng)液中；③PBS，pH7．2；④0．5％MFIT。
2．多聚甲醛固定法
（1）以105／孔效應(yīng)細(xì)胞置96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，可加用刺激物，如LPS（100ns／mL）刺激一定時間后，棄上清。
（2）PBS洗一次后，用1％多聚甲醛RPMI—1640室溫下固定15—20min，用PBS洗數(shù)次以去除多余甲醛。
（3）按效／靶細(xì)胞為10：1的比例加入靶細(xì)胞104／孔，分別設(shè)僅有靶細(xì)胞的對照組及僅有效應(yīng)細(xì)胞的對照組，終末體積100uL，37C，培養(yǎng)48h。
（4）加入10uLMTF／孔，孵育4ho
（5）再加入100gL0．IMmol／LHCl／10％SDS，37℃過夜。
（6）于波長570nm或630nm下測OD值。
3．單核細(xì)胞膜提取法
（1）單核細(xì)胞置于平皿經(jīng)刺激或不刺激培養(yǎng)后，用RPMI-1640洗三次。
（2）在平皿中加入0．5mL RPMI-1640，用橡皮刷將單核細(xì)胞刮下，懸浮于PBS（含lmmol／LEDTA及l(fā)mmol／LPMSF）中。
（3）破膜 將單核細(xì)胞放人“液氮細(xì)胞裂解器”，20min，350psi。
（4）2 500r／min離心10min，取上清。
（5）將上清置于43％蔗糖（溶于A溶液：10rmnol／L HEPES pH7．33mmol／LMgCl2），200 000Xg離心45rain，在蔗糖界面收集細(xì)胞膜。100mmol／L KCI
（6）用溶液A將細(xì)胞膜洗一次，175 000Xg離心60min，以去除殘留的蔗糖。
（7）將膜懸浮于RPMI-1640中，蛋白濃度為2—5mg／mL，—70~C凍存。用于生物活性檢測的濃度為10ug／孔，其余步驟同上。
