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金屬硫蛋白提取方法的介紹

時間:2011/4/22閱讀:1898
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金屬硫蛋白(metallothionein)是由由微生物和植物產生的金屬結合蛋白,富含半*的短肽,對多種重金屬有高度親和性。它是分子質量較低,半*殘基和金屬含量*的蛋白質。與其結合的金屬主要是鎘、銅和鋅,廣泛地存在于從微生物到人類各種生物中,其結構高度保守。

 

對于金屬硫蛋白的研究,國內外主要集中在提取、檢測以及應用上。由于在實際生產中,主要采用層析法,分離純化后的金屬硫蛋白中還含有其它的雜蛋白,因此本文作者正在進行金屬硫蛋白的分子印跡聚合物的研究,使其更好地應用于金屬硫蛋白的純化。

 

金屬硫蛋白在生物進化中高度保守,有四種異構體,MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多數哺乳動物的內臟器官中廣泛存在,尤以肝、腎細胞為主,而且參加其功能調節。MT-Ⅲ分布主要限于中樞神經系統,主要分布于星性膠質細胞(集中于細胞體和突起中),其次為神經元細胞,也有報道稱少量分布于生殖細胞、小腸、胃、腎和嗅覺皮質細胞中。MT-Ⅳ主要分布于皮膚、舌、消化道等器官的角質細胞和復層鱗狀上皮細胞中。

 

以下為金屬硫蛋白的提取方法介紹:

1、主要試劑:三羥甲基氨基甲烷(簡稱Tris);5,5-二硫二(2-硝基苯甲酸)(簡稱DTNB);PBS緩沖溶液。

2、動物的處理:參考Onsaka等的方法,給家兔皮下注射ZnSO44次,第1天注射60mg/只(約15mg Zn/kg),第2、4天注射90mg/只,第7天注射120mg/只,第8天處死動物取其內臟。

3、粗制品的制備:

1)稱重:將前一夜放-4℃冰箱中解凍的試樣拿出來用托盤天平稱重,試樣重量M,到0.1g;

2)攪碎:將試樣用剪刀剪成碎片后,用搗碎機搗約30~50s,搗成勻漿;

3)提取:加入相當于試樣重量兩倍體積的0.02MTris-HCl,用磁力攪拌器攪約半分鐘;

4)變性:加入等體積氯仿:乙醇(0.08:1)變性除雜蛋白,攪拌約5分鐘;

5)離心:5000rmp、4℃離心25min,棄沉淀,取上清;

6)熱變性:75℃熱變性3~5min除雜蛋白;

7)過濾:用冰塊速冷后用8層紗布過濾,取清液,靜置約2h;

8)離心:8000rmp、4℃離心25min,棄沉淀,取上清,得到勻漿液;

9)層析、凍干:對勻漿液進行層析,然后收集富含MT的層析液進行凍干即得MT粗品。

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