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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：550發布時間：2012-9-11
以抗體技術為基礎的免疫檢測應用和相關的疾病治療領域如癌癥，自發免疫紊亂等一直推動著抗體篩選研究的發展。單克隆抗體是會由特定的細胞系分泌到上清液中，而對上清液的篩選則成為了藥物研發的核心領域。
均相結合實驗
盡管ELISA和流式細胞儀等傳統手段被廣泛應用，但是這兩種檢測手段都存在很多的局限性，特別是對細胞表面低豐度抗原的檢測。同時，這兩種平臺需要很繁瑣的洗板和孵育的步驟而且耗費大量細胞和時間才能獲取數據。為了解決這些技術瓶頸，我們開發了mirrorball這個高靈敏度檢測平臺和“即混即讀”的實驗方案，這樣就大幅度的提高了抗體篩選的通量并且避免了繁瑣的實驗步驟。您所需要進行的實驗僅僅是將所有的反應物一次性的加入到孔中并孵育一段時間。這里待檢測的可以是結合在微球上的可溶性抗原也可以是細胞表面表達的抗原，一旦反應達到平衡狀態，那么結合了一抗的珠子和細胞可以很快的通過熒光標記的二抗來檢測到。由于mirrorball的這種高靈敏度特性，使得我們可以比流式和傳統ELISA更早的檢測樣品，并且只需要5ul左右的待測樣品。均相反應體系可以大幅度的減少試劑的消耗，特別適用于研究昂貴和低豐度的抗原。mirrorball的數據掃描和獲取
微孔板進行掃描時使用488nm和640nm的激發光。使用TTP LabTech公司的閾值算法和兩種形態熒光參數，每孔中的細胞都會 “on-the-fly”。。而使用mirrorball的圖像Cellista™軟件，我們可以進行全景掃描，得到數據可視化中的各種數據圖形（包括直方圖或散點圖，3D熒光強度分布圖）和整個微孔的圖片。
ABI 8200的數據掃描和獲取
使用640 nm激光掃描樣品，進行細胞計數和熒光總強度檢測，數據導出到Excel文件和處理。實驗數據僅僅收集了孔中心1 mm2面積區域。
數據結果
為了比較mirrorball和ABI 8200在EGFR檢測靈敏度方面的差異性，將A431細胞與梯度稀釋的EGFR一抗以及AlexaFluor647標記的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。 在用mirrorball分析時，用CFSE對細胞進行染色，預先定位細胞并進行計數，細胞量為384孔板每孔2000個。對于ABI的8200， A431細胞量為每孔8000個接種。
均相抗體結合實驗的分析
mirrorball和ABI 8200 FMAT 都在設計上融入了很多適用于均相結合實驗的特性。通過使用激光作為激發光源和光電倍增管作為檢測裝置，這使得它們能夠檢測到低親和力的抗體和低豐度的抗原的結合。兩個系統都在光路設計上zui大程度的降低了背景熒光并在掃描讀數的時候大幅度的提高了信噪比。在這個應用介紹里我們特別的比較了兩個平臺 mirrorball和ABI 8200 在通過細胞水平實驗進行抗體篩選時的性能優異性。通過對比，我們展示了mirrorball的多重熒光檢測能力，這使多重抗原標記并同時檢測成為了可能。
方法
細胞系和培養方法
在這項研究中，比較了mirrorball和ABI8200系統在進行A431細胞EGFR抗體結合實驗時的。 A431細胞在EMEM培養（EBSS）（Sigma公司）含10%胎牛血清，2mM*（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL*以及100 U / ml*。 A431細胞培養至80%匯合度時用0.25%*和EDTA收集，洗凈懸浮在培養基中。除非另有說明，培養試劑均購自Life Technology。
抗體和試劑
檢測抗體，鼠抗人表皮生長因子抗體（抗EGFR抗體），購自Merck Chmicals Ltd（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （#A21235）由Life Technologies公司提供。
CFSE標記
5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亞胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置為100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到細胞里并在室溫中孵育10分鐘。用4%FBS的PBS（2ml）終止反應。進一步孵化，于37° C下10分鐘后，細胞1000 x g離心5分鐘。
EGFR實驗
抗EGFR抗體在培養基中梯度稀釋，并添加20ul到384孔板中（Costar#3712）。對于mirrorball系統，暫停用CFSE標記A431細胞含有1 ×105個細胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。對于ABI的8200平臺，準備A431細胞的懸浮液包含4× 105細胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有熒光二抗的細胞懸液在37℃，孵育2小時。分別在mirrorball和ABI8200平臺上進行掃描并測定結合有EGFR抗體的細胞數量。zui后，mirrorball和ABI8200的濃度分別為2000細胞/孔和8000
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