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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：891發(fā)布時(shí)間：2012-2-7
【原理】
考馬斯亮藍(lán)G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)G－250在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢遺ui大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(1～100μg)，蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nM波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G－250結(jié)合在2Min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1H內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)快速靈敏(靈敏度比ＦolIn－酚法還高4倍)、易于操作、干擾物質(zhì)少(考馬斯亮藍(lán)G－250和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度差異不大)，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。但此方法也存在其缺點(diǎn)，考馬斯亮藍(lán)在蛋白質(zhì)含量很高時(shí)線性關(guān)系偏低，且不同來(lái)源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有差異。
【儀器與用具】
721分光光度計(jì)；10Ml量筒1個(gè)；研缽；燒杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，01Ml 3支；10Ml具塞刻度試管14支。
【試劑】
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白質(zhì)100μg／Ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液;
90％乙醇；
85％磷酸(W／V)；
考馬斯亮藍(lán)G－250溶液：稱取100μg考馬斯亮藍(lán)G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，zui后用蒸餾水定容到1000Ml，貯放在棕色瓶中，此溶液在常溫下可放置1個(gè)月。
【方法】
1標(biāo)準(zhǔn)曲線(蛋白質(zhì)含量為0～100μg／Ml)的繪制 取6支具塞試管，按表2－1數(shù)據(jù)配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白質(zhì)液各1Ml。
表2－1不同蛋白質(zhì)含量的牛血清蛋白質(zhì)液配制表
管號(hào)123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.200.400.600.801.00蒸餾水(ml)1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含量(μg)020406080100在每支試管中加入5Ml考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置2Min后，用1CM光徑比色杯在595nM下比色。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 吸取樣品提取液1.0Ml(樣品提取見LoWry法)，放入具塞試管中(每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)重復(fù))，加入5Ml考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，記錄吸光值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。
3結(jié)果計(jì)算
樣品中蛋白質(zhì)的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000(2-2)
式中C：查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg)；VT：提取液總體積(Ml)；
ＦW：樣品鮮重(g)； V1：測(cè)定時(shí)加樣量(Ml)。
商鋪：http://www.kindlingtouch.com/st32881/
主營(yíng)產(chǎn)品：ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，豚鼠ELISA試劑盒，兔ELISA試劑盒，羊ELISA試劑盒，牛ELISA試劑盒，雞ELISA試劑盒，鴨ELISA試劑盒，植物ELISA試劑盒
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