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自動生化分析儀基本參數及應用

閱讀：475發布時間：2011-11-7

 

了解生化分析儀基本參數的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測定數據。但是，配套系統的原裝分析參數不宜更改；采用非儀器配套的試劑及校準品體系時，參數修改要慎重，對于不同儀器、不同類型的反應分析程序，所顯示的人機對話分析參數信息有所不同。

一、反應監測時間

對于終點法來說，讀取反應達到平衡時的吸光度計算樣品中待測物的濃度。對于連續監測法來說，要注意觀察反應進程曲線，從而確定反應的預孵育期，延遲時間、連續監測的時段。對于一級或偽一級反應來說，連續監測的時間是一級反應的動態期的吸光度；對于基于零級反應的酶催化活性濃度速率法測定，連續監測的是零級線性反應期的吸光度。對于連續監測法來說，動態反應期的時間越長，越適用于臨床應用，對于以酶為工具的代謝物酶促動力測定法，要增加動態反應期，即延長反應達到平衡的時間，可在反應體系中加入競爭性抑制劑，這樣還可以提高測定的線性范圍，對于酶催化活性濃度連續監測法來說，一定要注意線性反應時間，有的酶，例如，以硫代丁酰*為底物的血清假性*酯酶速率測定法，線性反應時間只有90秒。對于連續監測法來說，在監測期至少應讀4個點（3個△A）。

多數*可以在整個測定反應周期連續監測（如HITACHI 7170常規測定周期10分鐘、監測34點，OLYMPUS AU 600固定周期8分15秒、監測27點），但反應監測時間是指該時間內的測定讀數要用于結果計算。它的設置與加樣點、加試劑點（包括R1、R2……）、監測時間（讀數點）、讀數間隔時間及試劑樣品比例等有關，要結合方法學，兼顧權衡。

1．反應時間（Reaction Time） 指儀器的一個分析周期中，試劑和樣品混合zui末一點測定讀數時間。它對終點法尤其重要，是終點法的瓶頸。有的儀器多個反應時間可選L如Hl—TACHI 7170），須預先選定。多數儀器10分鐘左右，這對試劑提出了較高要求。不少終點法試劑（尤其手工法試劑）反應時間常常也在lO分鐘上下，測定時間沒有余地，當樣品濃度高或試劑質量下降時，均可致測定結果偏低。因此，終點法不宜采用標明反應時間接近和長于儀器zui大反應時間的試劑盒。否則，必須用接近測定范圍上限的高濃度質控血清監測。

2．監測時間（讀數點）和讀數間隔時間各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數間隔時間短，監測時間也短。流動式生化儀讀數間隔時間一般較長。分立式生化儀一般監測時間10分鐘左右，間隔10-30秒讀數一次。有的儀器在整個測定反應周期全程讀數，有的只讀取時間（點）的吸光度。

3．加試劑點采用雙試劑時，加R2點決定R1與樣品的反應時間，也決定R2與R1及樣品的反應時間。一般儀器各5分鐘左右。HITACHI 7170有4個加試劑點，若采用雙試劑，各5分鐘，則加R2設在第3加試劑點。

4．反應監測時間還要考慮延遲時間的長短、測定物質的濃度范圍及相關臨床價值和工作效率等因素。

二、延遲時間

延遲時間（Delay Time）指試劑與樣品混合后到監測開始之間的時間。一般用于兩點法和速率法，某些情況下也用于終點法。終點法應選擇反應趨于平衡的時間（穩定期或平衡期）作測定，測定點前即所謂的孵育期。速率法的線性反應期之前即延遲期。正確選擇延遲時間的長短，有利于準確測定，減少試驗誤差。設置一般根據試劑盒的說明書，還應考慮本室的儀器特點和工作程序。

1．儀器特點 比如，半自動生化儀多為流動比色池，要考慮泵速、進樣管長短、反應液黏稠度及混合情況，以及室溫、反應液溫度同反應要求溫度間的溫差等。全自動生化儀的測定讀數設置方式不同，直接以“秒”設置，或以測定點設置、測定點間隔時間不一樣，需要靈活掌握。

2．試劑及方法學

（1）試劑組成在酶活性的連續監測法時，若試劑含工具酶數量多、偶聯反應多，則激活反應時間一般較長，延遲時間也較長，如肌酸激酶（NAC法）延遲時間常設置120-180秒；若試劑中底物經待測酶催化，其產物可以直接測定的，則延遲時間較短，如 -谷氨酰轉移酶（GGT）設定30-60秒。同一項目同一方法，但試劑配方不同，其反應快慢等特征也可能不同，如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠（BCG）為即時反應，10秒鐘內已完成，其后球蛋白等也將與BCG發生反應，所以孵育時間不能延長。但在同一測定時間，BcG濃度、緩沖液種類、pH和表面活性劑不J司的試劑，測定結果可能差異明顯。

（2）樣品異常成分干擾有的試驗項目需要用工具酶將內源性代謝產物耗盡，比如*氨基轉移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶（LDH）。如果使用單試劑，正常血清樣品延遲時間60秒即可；但當內源性酮酸增多（如酮癥酸中毒）時，試劑內LDH常常不能在60秒內*將其清除，剩余酮酸會進入監測期干擾測定，使測定結果偏高，所以延遲時間應增至90～120秒。采用雙試劑，則可在加入R1后即進入預孵育期。

（3）方法學要求比如肌酐（Jaffe法）測定的特異性不強，一般認為反應前20秒左右為乙酰乙酸等快反應干擾物呈色，后約80～100秒為蛋白質等慢反應假肌酐呈色，20~60秒肌酐呈色反應占主導地位。采用兩點法或速率法可減少干擾，但具體取多長的延遲時間，應根據試劑和儀器讀數特點，以干擾試驗等方法來評價決定。

3.工作程序 要在保證準確性的前提下，合理設置參數，提高工作效率。zui突出的例子是半自動生化儀上酶活性連續監測法的延遲時間設定。由于只能單份樣品逐一測定，若延遲時問全部設置在儀器內，每個延遲時間加監測時間至少1分鐘以上，守候時間較長。工作量大時，可以根據儀器控溫、加樣及讀數和試劑特點，以及室溫情況，將延遲時問挪一部分到機外，套式操作，但要確保機內延遲時間不要進入線性反應期。

4．要兼顧延遲時間和監測時間反應時間是有限制的。在速率法和兩點法中，延長延遲時間必然縮短線性監測期，減少測定的線性范圍，也易發生底物耗盡。

三、樣品量、試劑量與稀釋量

有關參數包括樣品量、試劑量、稀釋水量、zui小反應體積和zui大比色杯容量等。如HITACHI7170反應體積180~380µl，zui大體積570µ l。BT 224半自動生化儀流動比色池容積33µl，吸液量200～990µl，zui適體積500µl。

1．zui小反應體積 在儀器光度讀數要用于結果計算時，反應液液面高度不低于光度計光徑的zui小體積。它保證儀器的正確讀數和計算，也是儀器測定精度和經濟性的指針之一。在有的儀器中，它以反應體積的下限表示，有的則專門標明zui小反應體積。在單試劑測定中，樣品與試劑的總體積不得少于此參數。在雙試劑測定中，若R1與樣品的反應讀數不納入結果計算。R1自勺加液量可不考慮此參數，如連續監測法；否則應考慮它對結果的影響，如終點法在加R2之前讀數，并以此來扣除試劑或樣品空白時。

在半自動生化儀中，zui適吸人量相當于zui少反應體積。它與進液管道長度、流動比色池容積，吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關，它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此，吸人體積不能任意降低，必要時，應加大反應液量和吸人量。

2．zui大比色杯容量 這個參數含義明確。在有的儀器中，它以反應體積的上限表示，有的則專門標明zui大比色杯容量。反應液超過此體積，將致液體外溢，儀器測定系統被污損。

3．樣品試劑比例樣品與試劑的比例（SV：RV），也可表示為樣品體積分數——樣品體積與反應液總體積的比值（SV／TV），是方法學基本參數。酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應在10％以下。一般來說，待測物質在樣品中含量低的、生理波動范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應測定血清葡萄糖、*等，樣品試劑比例多為1：1OO，測定血尿酸或高密度脂蛋白*，常增加為1：50；ALT和AST的樣品試劑比例多為1：1O至1：20。方法靈敏、吸光度高的實驗方法，樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監測時間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為1：10。一般應以試劑說明為準，不宜輕易改動。

（1）改動樣品試劑比例，影響一系列方法學參數。若比例增大，則線性范圍縮小，線性反應時間縮短，樣品內源性干擾、基質效應增加、旁路反應會增強，方法特異性也下降。若比例減少，檢測信號偏低，信噪比（噪音／信號）增大，當儀器精度不高時，會加大測量誤差。

（2）改動樣品試劑比例，對某些反應有影響。如堿性磷酸酶（AI_P），有文獻報道：當樣品試劑比例從1：25降至1：50時，酶活力測定值增加，再低于1：50時不再增加。這一效應可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結果。體液樣品稀釋也可能對測定結果產生影響：④大多數蛋白質在濃溶液中的分子構象比稀溶液中穩定，樣品稀釋可影響酶的穩定性。（2）降低樣品中內源性抑制劑或激動劑的濃度，如以蒸餾水稀釋血清，可能因降低血清中*的激動劑氯離子的濃度，致測定*結果偏低；隨血清稀釋倍數增加，肌酸激酶測定活力增加，可能與降低樣品中AMt，、*等內源性抑制劑有關。

（3）雙試劑時要兼顧R1、R2和樣品三者的比例，尤其不宜改動試劑間的比例。R2要考慮儀器規定的加液zui小體積，同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費大的經濟問題等。

4．稀釋（水）量在加樣或加試劑時，加入去離子水或可以的液體。它的主要用途有兩個。一是用于濃縮試劑的稀釋，或樣品、校準品的稀釋。二是在樣品加量小的時候用來沖洗樣品探針，減小攜帶誤差；但用量不宜太多，以免稀釋試劑影響反應。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應液總體積考慮。必要時，干粉試劑復溶也要考慮此因素。

四、試劑空白（Reagent blank）監測參數

無樣品或以水代替樣品在反應過程中觀察試劑空白值或其變化情況，主要用于監測試劑質量及儀器穩定性，利用試劑空白對試劑本身或反應漂移引起的誤差進行補償，用以校正△A或△A/min。它與測定波長、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關，不能盲目套用，必要時宜實際測定。

1．試劑吸光度上限和下限定點監測試劑的吸光度。它常用規定波長及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測點因儀器和測定方法的不同而有差異。終點法常在PO點讀數，連續監測法常以反應監測起始點來判讀。儀器在試劑空白檢測及相關的校準測定時，若監測到超過此參數的限值，則提示試劑失效或校準無效。反應吸光度向上的試驗取上限值：如Trinder反應以酚或2-羥-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基*作用，生成紅色色素，試劑有一定的自發氧化，其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0. 1-0. 4。以結合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應吸光度向下的試驗取下限值：如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea（紫外法）等試驗，一般要求試劑吸光度下限≥1．0。

2．試劑空白速率顧名思義，它是在反應過程中對試劑空白的變化速率作連續監測，其數值在樣品測定結果中自動扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對試劑空白速率有影響。在酶促反應中，試劑空白速率也是試劑在監測過程中底物自發降解的結果。底物為還原型輔酶者，本身不穩定而分解，多呈下降趨勢；以硝基*或苯胺的衍生物作底物，在堿性環境中自發水解成被測物質，多呈上升趨勢。此參數主要用于連續監測法。一般認為酶活性測定的試劑空白速率（△A/min）應≤0. 001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測下限、正常參考范圍下限等指標有關，有時也以濃度單位表示。要根據K值、儀器穩定性、方法允許變異而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應≤10％，其試劑空白速率應≤4．0U／L。一些儀器的程序參數中沒有此參數，但我們應在試劑空白的測定資料中關注它，若資料波動大，須查找試劑或儀器原因。

3．試劑空白的日常監測測定方法設置了試劑空白的項目，都要先行作試劑空白測定，在樣品測定計算中自動扣除。由于試劑空白不是在每一個樣品測定中實時測定并扣除，當樣品測定中試劑的變化在未達到參數設置限值時不易發現，試劑空白扣除會產生誤差。所以，應根據試劑的穩定性確定試劑空白及相關的校準的測定頻率。連續監測法的試劑應每天（尤其在換另瓶或另批號試劑時）常規測定此參數。對樣品的異常結果．也應及時對其測定吸光度資料（包括與試劑空白有關的資料，例如PO點讀數）觀察分析。

4.有的半自動生化儀沒有試劑吸光度上限和下限設定，但一般在測定屏幕都顯示初始吸光度值，應人工加以判斷。酶活力測定結果呈負值，有時可能與試劑空白錯誤有關。

5．試劑吸光度上限和下限不是試劑質量的*指針。因此，一定的校準頻率和室內質控是質量保證的必需手段。我們在實際工作中就遇到酶活力測定的試劑空白數據在規定限值內，但質控物測定結果連續偏低，病人結果因每天標本少而難以判斷，zui后發現是試劑質量下降。

五、波長的選擇及測定模式

波長（Wave 1ength）的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差。光度學方法有單波長和雙波長之分，有的儀器可用三波長、甚至多波長，以及兩波長比率等。有的儀器可作導數光譜分析。單波長測定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長測定可以通過副波長加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測定準確性。采用同光束雙波長，亦有利于排除光源強度變化對結果的影響。

1．測定波長選擇有三個主要條件：

（1）待測物質在該波長下的光吸收zui大。

（2）其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說，該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小。

（3）常見干擾物在該波長下的光吸收zui小。試劑盒說明一般已提供波長參數。實際波長選擇需要了解待測物質和干擾組分對不同波長單色光的吸收程度，即以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標作吸收光譜曲線（光吸收曲線）。

采用透射免疫比濁法，免疫復合物大小約35~100mn之間，于波長290~410nm下有zui大吸收峰，常取340nm；如用膠乳增強免疫濁度法，理想的檢測波長可增至可見光區。

2．雙波長測定當待測物質與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現非特異光吸收，或因反應液混濁出現光散射時，可以采用雙波長（或多波長）測定。雙波長測定的原則是根據干擾組分和待測物質吸收光譜的峰形特征，選擇兩個波長和 ，使干擾組分在這兩個波長處的吸光系數相等，而使待測物質在兩波長處的吸光系數有顯著差別。以兩波長分別測定分析溶液的吸光度，以兩個吸光度值之差（△A）計算。雙波長選擇常見：血紅蛋白340nm和380nm波長吸光度相同，以NADH或NADPH作為測定底物或產物的試驗常采用340／380nm；有的也．采用340／405nm。ALP和GGT常使405/476nm，Trinder反應多選取520／600nm或550/660nm．免疫比濁常選用340／700nm等。

連續監測法中，要注意雙波長測定有兩種類型的機型：主波長全程監測副波長單點監測，和雙波長全程監測。不僅因為后者的準確性優于前者，而且因為酶活性測定的K值計算與波長及摩爾吸光系數有關，更顯重要。

副波長單點監測：試劑和樣品混合后，雙波長只測一點，此后只用主波長連續監測；計算時，全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計算代入主波長摩爾吸光系數即可。機型如Monarch 1000 ，Technicon RA 1000等。

雙波長全程監測：全程每～測定點均用雙波長同測，并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因為所測指示酶或產物在λ副波長時也存在一定的吸光系數，K值計算代入的摩爾吸光系數值應采用ε主減去ε副。如NADH的ε 為6．22×10 ， 為1．33×10 ，ALP產物ε 為18.5x×10 ，ε 為0.2×10 很小；GGT產物在副波長處無吸光系數。


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