在RIA中，標記抗原質量的優劣，直接影響測定結果，必須制備比放射性強、純度高的標記抗原，并保持免疫活性不受喪失。
一、同位素的選擇
同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標記抗原，常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其優缺點，可根據所進行的放射免疫分析的類型特點，標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇（表8-1）。大多數抗原分子中都含有C、H等原子，所以用14C或3H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性，且14C、3H半衰期長，所標記的抗原長時間放置后仍可使用，這都是其優點。14C或3H標記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標記物；3H及14C放出的都是弱β射線，需用較昂貴的液體閃爍計數器方能獲得較率的測量，且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者，則仍以采用3H或14C標記物為佳。
表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質
| 放射性元素 | 半衰期 | 射線種類及能量（百萬電子伏特） |
| | | β | γ |
| 14C | 5720年 | 0.155 | － |
| 3H | 12.5年 | 0.0189 | － |
| 125I | 60天 | － | 0.035 |
| 131I | 8.05天 | 0.608，0.335，0.250 | 0.364，0.637，0.722 |
大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構，往往容易損傷抗原的免疫化學活性；且放射性碘的半衰期較短，標記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用，放射性碘放出γ—射線，用一般晶體閃爍計數器就能獲得較率而的測量，測量操作也很簡單。由于這些突出的優點，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標記物zui多。
從應用角度來看，131I和125I又各有其優缺點，可根據實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規格等條件合理選用。但相對而言，125I有較多的優點，一是半衰期適中，允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間；二是它只發射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無β粒子，因而輻射自分解少，標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對象（包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等）的標記，且操作簡單，一般實驗室都不難做到。
二、蛋白質與多肽激素的
要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標記，則標記后必須采取適當的步驟除去雜質，以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質（這時表面上活性可能還是良好的），再經標記反應時所受的損傷，活性就會顯著降低，影響以后的放射分析結果。有了好的純抗原，還要采用適當方法加以標記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。
多肽激素與蛋白質多用碘標記，zui常用的是125I。碘化反應的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（125I-）氧化成的碘分子（125I2），再與多肽激素、蛋白質分子中的*殘基發生碘化作用。所以不管采用哪一種法，標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團，即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原，在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的，放射性碘無法標記，必須在這些化合物的結構上連接上述基團后才能進行碘標記。
因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質、多肽分子中*殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應條件（pH、溫度、反應時間等）及所用氧化劑的性質等也有影響。
（2）生物活性和免疫活性測定的要求：需根據使用要求而定，因為同一標記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關；同一標記激素，其與受體結合能力的改變與抗體結合能力的改變也不一定平行。 （3）測定方法：測定標記蛋白質或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：
①物理化學方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過濾法等物理化學方法來測定標記蛋白質的結構改變情況，如標記后受損全傷的蛋白質在電泳時泳動性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質也有改變，而蛋白質變性聚合時大分子聚合體將在凝膠過濾時不停留在凝膠柱上。這些測定雖較快速方便，但對標記物的生物活性和免疫活性的嚴格判定來說，還是很不夠的。
②特異結合試驗：根據放射性標記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應抗體或受體進行特異性結合試驗。以放射免疫分析試劑為例，測定其免疫活性的方法是：先觀察標記物與抗體的結合率，如果結合率高，說明抗原的免疫活性較好。進一步觀察標記抗原與非標記對抗體親合力是否一致，做法之一是用不同稀釋度的抗體，分別與標記抗原及與標記抗原加非標記抗原的混合物進行特異結合，其中混合物抗原總濃度要和單獨使用放射性抗原的濃度相同。如單獨使用標記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng，非標記抗原為0.9ng，比較兩者的結合率，如果基本相同，說明標記抗原保持其原來的親和力，在標記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。
圖8-5 標記蛋白的免疫活性測定
A；為標記抗原與血清的滴度曲線B：為非標記抗原（加入少量標記抗原）的滴度曲線；C：與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低
③生物特性測定：如125I—纖維蛋白原，可用*測定其可凝能力，與非標記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測定，根據標記物的生物性質而定。另外，上述特異性結合試驗，如果受體作異結合劑，也是檢驗用作RRA或RBA分析試劑的標記物生物活性情況的有效方法。
