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上海酶聯(lián)生物研究所


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核酸凝膠電泳觀察法

閱讀:516發(fā)布時間:2011-11-2

實驗原理:瓊脂糖是海藻中提取的線狀高聚物,不同濃度的瓊脂糖密度不同,一般PCR產物使用2%濃度,0.5Kb-10Kb的DNA使用1%濃度,基因組DNA使用0.3%-0.7%濃度;不同大小的核酸在同一濃度的凝膠中遷移率不同,因為分子越大其受瓊脂糖的阻力越大,遷移率與堿基對的對數(shù)值成反比;同分子量不同構象的核酸遷移率也不同,超螺旋環(huán)狀DNA遷移率>線狀DNA遷移率>帶切口環(huán)狀DNA遷移率。

熒光染料溴化乙錠可嵌入DNA堆積堿基間,DNA吸收的254nm的紫外輻射與溴化乙錠在302nm和366nm處的光吸收可在590nm處(可見光紅橙區(qū))發(fā)光,利于觀察,用于核酸凝膠鑒定。

一、實驗材料

瓊脂糖、溴化乙錠(10mg/ml)、6×loading buffer、凝膠電泳緩沖液(1×TAE或0.5×TBE)、電泳儀、電泳槽、微波爐

50×TAE(儲存液): 242g/L Tris堿

57.1ml/L 冰乙酸

100ml/L 0.5M EDTA (PH 8.0)

6×loading buffer:0.25% 溴酚蘭

0.25% 二甲苯青FF

15%聚蔗糖(Ficoll 400型)(pharmacia)

瓊脂糖(promega)

二、實驗方法

1.配置凝膠電泳緩沖液,用相應的凝膠電泳緩沖液配置相應濃度的凝膠。

2.微波爐加熱使凝膠融化,溫度降至60℃左右加入溴化乙錠(終濃度為0.5μg/ml)混勻。

3.將膠倒入槽中至厚度約3-5mm左右,梳子距槽底1-2mm,并去除氣泡。

4.倒入凝膠電泳緩沖液,小心拔去梳子。

5.DNA樣品與6×loading buffer混勻加入凝膠加樣孔中,接上電源,電壓降采用1-5V/cm,DNA由負極向正極移動。

6.電泳一般30分鐘足矣,可根據(jù)溴酚蘭和二甲苯青FF的位置延長電泳時間,電泳完畢,UV下觀察。

三、注意

1.溴化乙錠是強誘變劑兼有中毒毒性,使用時必須戴手套。

2.不同的DNA樣品需不同的電泳方案,需參見文獻。本文為一般常用法。

 


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