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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：2747發(fā)布時(shí)間：2011-10-25
【原理】
免疫沉淀反應(yīng)（Immunoprecipitation）主要用于抗原或者抗體的定性檢測(cè)。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例所形成的可見(jiàn)沉淀物現(xiàn)象。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計(jì)的沉淀實(shí)驗(yàn)主要包括絮狀沉淀試驗(yàn)，環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)。凝膠內(nèi)的沉淀試驗(yàn)依所用的實(shí)驗(yàn)方法又可分為免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和免疫電泳技術(shù)2類。
【材料】
1. 蛋白A 或蛋白G
2. 一抗
3. 免疫沉淀緩沖液：20 mM 磷酸鈉, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脫氧膽酸鈉 and 0.02% *. （> NOTE: 50 mM 醋酸鈉緩沖液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%*也可作為免疫沉淀的緩沖液，能提高蛋白G的結(jié)合功效）
4. 洗脫液：0.1 M *-HCl buffer, pH 2.5
5. SDS-PAGE 上樣緩沖液 （pH 6.8）： 2% SDS, 62.5 mM Tris 堿, 10% 甘油, 2-5% 2-巰基乙醇
【步驟】
1. 用50 µl免疫沉淀緩沖液溶解抗原，向溶液中加入1倍過(guò)量的特異性一抗。加入免疫沉淀緩沖液至樣品體積為0.2 ml。一般情況下，在此體積下2-5µg的純化抗體能夠較好地形成抗原抗體復(fù)合物。
2. 樣品4℃.孵育過(guò)夜。
3. 將適量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗體復(fù)合物中（~ 50 µl of gel per 5 µg of antibody）。
4. 室溫下，輕柔混勻樣品，孵育2小時(shí)。
5. 用0.5ml免疫沉淀緩沖液洗蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物，離心2-3分鐘，棄上清。重復(fù)此步驟至少6次。
6. 用50 µl洗脫液孵育蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物5分鐘，將抗原抗體復(fù)合物從蛋白A或蛋白G上洗脫下來(lái)，離心，收集上清。另用50 µl洗脫液孵育膠5分鐘，離心，收上清。將兩個(gè)上清混合。
7. 立即調(diào)節(jié)蛋白樣品的pH至生理值，用一種合適的、多次離心的緩沖液調(diào)節(jié)，如1.0 M Tris, pH 7.5 （10 µl of this buffer to 100 µl of the supernatant should be sufficient）.
8. 將洗脫成分除鹽。
9. 準(zhǔn)備好樣品待定性。
NOTE：如果用SDS-PAGE定性蛋白質(zhì)，省去步驟6-9。在完成第5步之前，用0.5ml蒸餾水洗膠。離心蛋白A或蛋白G 2-3分鐘，棄上清。用25µl SDS-PAGE上樣緩沖液在95°C孵育蛋白A或蛋白G連接的抗原抗體復(fù)合物5分鐘。樣品離心，收集上清。重復(fù)一次，匯集上清至總體積50µl。由此樣品則準(zhǔn)備妥當(dāng)。
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