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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：328發布時間：2011-9-21
培養人臍靜脈內皮細胞：
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 新生兒臍帶 由重慶醫科大學附屬*醫院提供。在無菌條件下，于健康產婦分娩后立即取新生胎兒臍帶。長度>20 cm，兩端扎緊投入到4℃臍帶保存液中，1 h內送細胞培養室。
1．1．2 儀器與試劑倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺（蘇州凈化儀器廠）；5％C02培養箱（美國Heraeus公司）；離心機（上海安亭儀器廠）；25cm2培養瓶、六孔培養板（美國CA）star公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；促內皮細胞生長添加物（ECGS）、M199培養基、I型膠原酶（美國Sigrna公司）；明膠、*（美國A1Tlresco公司）；滅菌生理鹽水（錦州醫學院附屬*醫院制劑室）；鼠抗人Ⅷ因子單克隆抗體、辣根酶標記的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
1．2 方法
1．2．1 試劑配制 ：（1）臍帶保存液：生理鹽水、葡萄糖100 mmoL／L、100 U／ml*一100 U／m1*。（2）磷酸鹽緩沖液（PBs）。（3）D—Hanks液。（4）0．1％ I型膠原酶：用PBS配制。（5）0．05％*一0．02％ 乙二胺四乙酸二鈉鹽（ED—TA）溶液：用D—Hanks液配制。內皮細胞培養液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1*一100 U／m1*的M199培養基。（7）0．2％ 明膠：用PBS配制。以上試劑均過濾除菌。
1．2．2 人臍靜脈內皮細胞的分離與原代培養： 參照Jaffe 和Lin S等方法并加以改進。在無菌條件下取新生胎兒臍帶，長度>20 cm。剪去臍帶兩端和臍帶上有夾痕及血腫部分，盡量擠干凈臍帶內血液。用生理鹽水沖洗臍帶表面至無血色。用*內接有*的軟管，找到臍靜脈，將軟管針頭一端插入臍靜脈，用止水夾固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反復沖洗臍靜脈直至無血色液體流出為止；將臍帶另一端用*夾閉，向臍靜脈中灌入0．1％ I型*，使之充盈，夾閉軟管，37℃水浴中孵育20 min，其間輕輕擠壓并旋轉臍帶，以使酶溶液充分接觸血管內壁，然后將細胞一酶溶液收集于預先裝有溫培養液小三角瓶中。用2倍于消化液的溫PBS沖洗臍靜脈，一并收集于小三角瓶中，將細胞懸液裝入10 ml離心管，1 000 r／min離心10 min，棄上清，吹打懸浮，再次離心10 min，重懸細胞并接種于鋪有明膠的25 cm2培養瓶中，置于37℃ 5％ C02飽和濕度培養箱中培養，24 h后更換培養液，以后每隔2 d換液1次。
1．2．3 人臍靜脈內皮細胞的傳代培養 當原代細胞融合80％以上后，加入0．05％ *一0．02％EDTA 溶液消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞皺縮變圓、彼此分離時棄消化液，加入細胞培養液終止消化，收集細胞懸液。1 000 r／min離心10 min，棄上清，制成單細胞懸液。此時可用0．5％臺盼藍染色，計算活細胞百分率，并以*計數。調整細胞濃度為1×10 個／ml，接種于培養瓶或培養板中繼續培養。待細胞長滿，彼此融合成片時依上述方法繼續傳代培養。
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