液相色譜法
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※ 液相色譜法、液相色譜兩相的分類、液相與氣相的區別
是繼氣相色譜之后，70年代初期發展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。
液相色譜是在氣相色譜和經典色譜的基礎上發展起來的。現代液相色譜和經典液相色譜沒有本質的區別。不同點僅僅是現代液相色譜比經典液相色譜有較高的效率和實現了自動化 操作。經典的，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現代引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送（zui高輸送壓力可達4.9×107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。因此，液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、或現代。
一、液相色譜儀的兩相與分類
液相色譜分離原理及分類和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統也由兩相——固定相和流動相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。色譜分離的實質是樣品分子（以下稱溶質）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。
根據分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。
二、液相色譜與氣相色譜的比較
液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動相，而液體和氣體的性質不相同；此外，液相色譜所用的儀器設備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：
（1）應用范圍不同
氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質。對高沸點化合物、非揮發性物質、熱不穩定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應用受到一定程度的限制，據統計只有大約20%的有機物能用氣相色譜分析；而液相色譜則不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70 ～ 80%。
（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作
因為： ① 氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。 ② 液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。 ③ 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。
（3）由于液體的擴散性比氣體的小105倍，因此，溶質在液相中的傳質速率慢，柱外效應就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區域擴張可以忽略不計。
（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復雜，價格昂貴。在實際應用中，這兩種色譜技術是互相補充的。綜上所述，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應用范圍廣等優點。該法已成為現代分析技術的重要手段之一，目前在化學、化工、醫藥、生化、環保、農業等科學領域獲得廣泛的應用。
※ 液相色譜儀的組成
液相色譜儀由 高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統、記錄系統等五大部分組成。
分析前，選擇適當的色譜柱和流動相，開泵，沖洗柱子，待柱子達到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進樣口，流動相把試樣帶入色譜柱進行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，zui后和洗脫液一起排入流出物收集器。當有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉變成電信號，經過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據。
一、高壓輸液系統
高壓輸液系統由 溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表 等組成。
1.溶劑貯存器 溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2 L，用來貯存足夠數量、符合要求的流動相。
2.高壓 高壓是液相色譜儀中關鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續不斷地送入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細，所填固定相粒度很小，因此，對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓泵注入流動相。
對泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動，流量精度和重復性為0.5%左右。此外，還應耐腐蝕，密封性好。高壓，按其性質可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動相粘度和柱滲透無關。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統阻力不發生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。
3. 梯度洗脫裝置
梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。
梯度洗脫裝置分為兩類：
一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統，僅需一臺泵即可。另一類是內梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統。
梯度洗脫的實質是通過不斷地變化流動相的強度，來調整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以*平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質k值的變化是通過溶質的極性、pH值和離子強度來實現的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到。
二、進樣系統
進樣系統包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。
三、分離系統
分離系統包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內部拋光的不銹鋼制成。其內徑為2 ～ 6mm，柱長為10 ～50cm，柱形多為直形，內部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。
四、檢測器
檢測器是液相色譜儀的關鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類型的檢測器，一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學特性有響應。屬于此類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等；另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理和化學性質響應。屬于此類檢測器有示差折光檢測器等。
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