兔基質金屬蛋白（MMP-9）ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究研究使用
預期應用
ELISA法定量測定兔血清、血漿、唾液、細胞培養物上清或其它相關液體中MMP-9含量。
概述
MMP-9是基質金屬蛋白酶（MMPs）家族中的一員，為Ⅳ型膠原酶，可有效降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原及明膠，它的異常表達與兔類許多惡性腫瘤的轉移密切相關。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一種金屬離子依賴的蛋白酶。MMP-9其主要功能是降解細胞外基質,參與體內多種生理及病理過程如胚胎發育、創傷修復、血管形成、炎癥、腫瘤的侵潤及轉移、結締組織病等。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中MMP-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、*化的抗兔MMP-9抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-9呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成
1. 酶聯板：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.63ng/mL，0.31 ng/mL，0.15 ng/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內配制。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。
7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標本的采集及保存
1．細胞培養物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。
2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2．為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層
吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的兔MMP-9，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2． 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
3． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
4． 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
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