人褪黑素（MT）ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用
zui低檢測(cè)限：12.5 ng/ml
特異性：本試劑盒可檢測(cè)人MT，且與其他相關(guān)物質(zhì)無(wú)交叉反應(yīng)。
有效期：6個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中MT含量。
說(shuō)明
1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。
2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用酶聯(lián)免疫直接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)MT。微孔板上包被有抗體MT抗體。加入MT標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，然后加入*標(biāo)記的MT。樣品中的MT、*標(biāo)記MT與固相板上的抗MT抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。再向微孔中加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，形成固相抗體-*化MT-親和素-HRP復(fù)合物。經(jīng)加底物顯色后，隨著樣品中MT濃度的升高，顯色OD值呈逐漸下降的線性關(guān)系。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：5×1ml/瓶。
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 |
| 濃度 （ng/ml） | 25 | 50 | 100 | 200 | 400 |
3. *標(biāo)記MT：1×6ml/瓶。
4. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-Avidin ）：1×6ml/瓶。
5. 底物溶液A（Substrate A）：1×6ml/瓶。
6. 底物溶液B（Substrate B）：1×6ml/瓶。
7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
8. 終止液（Stop Solution）：1×6ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 超聲清洗器
5. 干凈的試管和Eppendof管
6. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
7. 蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
濃洗滌液稀釋原則：
臨用前用蒸餾水進(jìn)行20倍稀釋。如有鹽析出，稀釋后水浴加溫助溶。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，*行稀釋?zhuān)允箻悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔不加任何溶液，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul *標(biāo)記MT（空白孔中不加）。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘（為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液）。
2. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3-5次，每次浸泡10秒，約200ul/每孔，甩干。
3. 所有孔中加入50 ul辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘
4. 按步驟2進(jìn)行洗滌。
5. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，一般10-15分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的后3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
注：
1. 用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。
5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 底物請(qǐng)避光保存。
7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
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