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廈門慧嘉生物科技有限公司
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閱讀：157發布時間：2013-4-19
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人 人人 人Ⅳ ⅣⅣ Ⅳ型膠原 型膠原 型膠原 型膠原（Col Ⅳ ⅣⅣ Ⅳ）酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號： ：： ：CSB-E04803h
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：3.12 ng/ml - 200 ng/ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：0.78 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人 Col Ⅳ，且與其他相關蛋白
無交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ： ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中 Col Ⅳ
含量。
說明 說明 說明 說明
1. 試劑盒保存：未開封的試劑盒應儲存于 2-8℃；開封后的酶標板應與干燥
劑一起儲存于鋁箔袋中置于 2-8℃保存。僅在此出儲存條件下，產品在有
效期內可正常使用。
2. 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4. 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實
驗結果造成任何影響。 2
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 Col Ⅳ抗體的微孔
中依次加入標本或標準品、*化的抗 Col Ⅳ抗體、HRP 標記的親和素，
經過*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，
并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 Col Ⅳ呈正相關。
用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯板 酶聯板 酶聯板 酶聯板（Assay plate ）： 一塊 （96孔）。
2. 標準品 標準品 標準品 標準品 （Standard）： 2 瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。
4. *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）： 1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ） 1×10ml/瓶。
6. *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）： 1×120µl/瓶（1： 100）。
7. 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）： 1×120µl/瓶（1： 100）。
8. 底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）： 1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ） 1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。
10. 終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）： 1×10ml/瓶。
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養箱
4. 干凈的試管和 Eppendof 管
5. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等 3
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，
取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但
應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。
2. 血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8°C
1000 g離心 15 分鐘，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于
-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后
檢測。
3. 細胞培養物上清或其它生物標本：1000g離心 20 分鐘，取上清即可立即
檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。
注 注注 注： ：： ：標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。
標本的稀釋 標本的稀釋 標本的稀釋 標本的稀釋原則 原則 原則 原則： ：： ：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。
只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應
做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，使用前于 6000-10000rpm 離心 30 秒。 每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上，然后反復顛倒
/搓動以助溶解，其濃度為 200 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋 200 ng/ml,
100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml，樣品稀
釋液直接作為標準濃度 0 ng/ml，臨用前 15 分鐘內配制，用完丟棄，下次檢
測使用新鮮配置的標準品。
如配制 100 ng/ml標準品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）200 ng/ml的上述標
準品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此
類推。 4
*標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以*標記抗體稀釋液稀
釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔 100µl），實際
配制時應多配制 0.1-0.2ml。如 10µl*標記抗體加 990µl*標記抗體
稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過氧化物酶標記親和
素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔
100µl），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如10µl辣根過氧化物酶標記親和素
加 990µl 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時內配制。
操作步 操作步 操作步 操作步驟 驟驟 驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。加樣時，槍頭應直接對
準液面，切勿沿孔壁加樣。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100µl，
余孔分別加標準品或待測樣品 100µl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，
37℃反應 120 分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。 5
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液 100µl （取 1µl
*標記抗體加 99µl *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內配制），37 ,60 ℃ 分鐘。
3. 溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同*標記抗體工作液）
100µl，37℃，60 分鐘。
5. 溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液 90µl，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內，此時肉眼可見標
準品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液 50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加
入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底
物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到
管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及終止液。測量時先用此孔調 OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上
蓋或覆膜。 6
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8℃保存。標準品、*標記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請
勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算 計算 計算 計算
請從我們的下載專業軟件"Curve Exert 1.3"，并根據提示制作標準曲線。
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對
數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；
再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即
為樣品的實際濃度。
注意 注意 注意 注意事項 事項 事項 事項
1. 本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 48T 試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒， ，， ， 48T 試劑盒中酶聯板 試劑盒中酶聯板 試劑盒中酶聯板 試劑盒中酶聯板、 、、 、標準品 標準品 標準品 標準品、 、、 、* * * *
標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半 標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半 標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半 標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半。 。。 。
2. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。 7
3. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
4. 一次加樣時間控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
5. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
6. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數。
7. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
8. 底物請避光保存。
9. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
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