【關鍵詞】 食源沙門菌DNA環(huán) 恒溫核酸擴增法檢測
沙門菌是食源性致病菌中一個主要的屬，在各類細菌性食物中毒事件中，沙門菌造成的食物中毒位居前列〔1，2〕。常規(guī)的沙門菌檢測方法費時費力，已經不能滿足食品生產質量控制的要求〔3〕。因此，需要開發(fā)一種靈敏度高并且反應迅速的方法。Notomi等開發(fā)出一種新的恒溫核酸擴增法—環(huán)介導恒溫核酸擴增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)〔4，5〕。本研究利用DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法對市售不同生肉來源的沙門菌進行快速檢測，并且著重在靈敏度和特異性方面對此方法進行驗證，以建立的LAMP反應條件能夠對今后病原微生物的檢測研究工作提供參考依據。
1 材料與方法
1.1 菌株 豬霍亂沙門菌豬霍亂亞種ATCC13312(S.ATCC13312)(廣東省微生物研究所)；其余5株沙門菌HB009，HB371，HB069，HB215，HB143分別分離自市售的生豬肉、海產品、生牛肉、生羊肉和雞肉。其他屬菌株共14株保藏于本實驗室，作為沙門菌環(huán)介導恒溫核酸擴增反應特異性試驗中的對照菌株。所有菌株均保存在質脂雙層(LB)培養(yǎng)基中。
1.2 儀器及試劑 HtPot40恒溫金屬浴(合肥艾本森科學儀器有限公司)；PCR擴增儀ABI2700(美國ABI公司)；凝膠成像系統(BIO-RAD Gel Doc EQ凝膠成像系統)。Bst大片段DNA聚合酶(愛爾蘭Biolabs公司)；甜菜堿(分析純，美國Sigma公司)；瓊脂糖以及引物合成(大連TaKaRa生物公司)。
1.3 方法
1.3.1 LAMP反應引物設計 以沙門菌的屬特異性基因invA〔6，7〕為靶基因，選擇位于8 091～331之間的DNA序列作為LAMP擴增區(qū)域。將待擴增的DNA分為6個獨立的區(qū)域，根據這6個區(qū)域分別設計LAMP反應所需2對引物(內引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。FIP由F2和F1C兩部分組成，BIP由B2和B1C兩部分組成，其2個部分都能分別識別靶DNA正義鏈和反義鏈獨立區(qū)域。外引物F3和B3分別識別靶DNA上F2和B2的外側的獨立區(qū)域，F3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′；B3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2對引物識別靶DNA上6個獨立區(qū)域。FIP由22個堿基F1C和20個堿基F2，以及中間連接的TTTT組成，序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′；BIP由21個堿基B1C和20個堿基B2，以及中間連接的TTTT組成，序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′(引物由大連寶生物公司合成)。
1.3.2 LAMP反應 (1)DNA模板制備：DNA提取參照文獻〔8〕。(2)LAMP反應體系：25μl反應混合物包括各1.6 μmol/L的FIP和BIP，各0.2 mol/L的F3和B3，1×恒溫緩沖液，1 mol/L的甜菜堿，6 mmol/L的MgSO4，1.6 mmol/L的dNTP，8 U/μl的大片斷DNA聚合酶，1 μlDNA。(3)反應過程：除了大片斷DNA聚合酶，將其余的試劑混合物于95℃反應5 min，使DNA變性。然后迅速于冰上冷卻，并加入Bst聚合酶，將反應物混勻，置于65℃恒溫金屬浴中反應60 min，zui后在80℃條件下反應5 min結束反應。(4)LAMP產物檢測：肉眼觀察反應物的外觀變化并在2%瓊脂糖凝膠上100 V電泳分離25 min，加樣量7 μl/上樣孔。凝膠置于EB中染色10 min，水洗10 min，在BIO-RAD Gel Doc EQ凝膠成像系統下照像檢測。
