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| 細胞培養常見問題 1. 液體培養基的保存是冷藏好？還是冷凍好？ 要冷藏！！因為液體培養基經冷凍后再經溶化時，其溶液的pH值會發生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會受到影響對細胞生長不利。故液體培養基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年。 2. 液體培養基中*的作用，及使用方法。 幾乎所有的細胞對*有較高的要求，細胞需要*合成蛋白質，在缺少*時，細胞生長不良而死亡。所以，各種培養液中都含有較大量的*。*在溶液中很不穩定，應置-20 ?C冰凍保存，用前加入培養基中。加有*的液體培養基4 ?C 冰箱儲存兩周以上時，應重新加入原來量的*。基礎醫學細胞中心在其服務項目中配制分裝了高濃度（100倍）的*溶液（1ml/支）。每支1ml的*加到99ml*培養基中，其終濃度為2mM/ml培養基。包裝為粉紅色，-24?C保存。 3.培養用液pH對細胞生長的影響 由于，大多數細胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不*相同，原代培養細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。 但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些，偏酸環境中更利于細胞生長。因此，我們在配制培養用液時，可把液體的pH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。 4.常用培養基及培養用液的滲透壓范圍 培養基名稱 滲透壓范圍（mOSM） DMEM（高糖） 315 ~ 350 DMEM（低糖） 270 ~ 330 RPMI-1640 260 ~ 290 MEM-EBSS 280 ~ 310 MEM-NEAA 280 ~ 310 McCoy 280 ~ 310 MEM-a 280 ~ 310 M—199 275 ~ 305 IMDM 270 ~ 300 DMEM/F-12 280 ~ 310 F—10 270 ~ 300 F—12 275 ~ 300 培養基名稱 滲透壓范圍（mOSM） L—15 280 ~ 320 D-Hanks 280 ~ 300 Hanks 280 ~ 300 PBS 275 ~ 300 5.細胞傳代消化時所用*濃度越高越好嗎？ 不見得！因為*溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、*濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力zui強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復沖洗細胞培養瓶，以便于將含血清的培養基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液濃度為： （1）０.０５％*＋０.０２％ＥＤＴＡ； （2）０.２５％*＋０.０３％ＥＤＴＡ。 （3）0.25% * 溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制。 多數細胞傳代消化可使用０.０５％*＋０.０２％ＥＤＴＡ這種消化液。 6.培養基在使用過程中應注意的問題： （1）. 培養基在使用前需37 oC預熱或在室溫平衡后再使用。 （2）. 細胞培養過程中，吸取過培養液的吸管不能再用火焰燒灼，防止殘留在吸管內的培養基焦化，將有害物質帶入培養液中。 （3）. 盡量縮短各種液體、細胞的暴露時間。 （4）. 避免液體間、細胞間的交叉污染。 （5）.配制*培養基時，配制的量在2周內用完為好。 7.血清的有關問題： 新生牛血清：新出生牛5天內取血制成 小牛血清：小牛出生16周以內采血制成。 胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎制成。 國內廠家往往不能做到，經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。 根據血清的生產工藝及血紅蛋白、內毒素含量又分為： （1）.特級胎牛血清：40納米過濾，內毒素含量≤10EU， 血紅蛋白含量≤10mg/dl。 （2）.優等胎牛血清：經過3次100納米過濾， 內毒素含量≤25EU/ml， 血紅蛋白含量≤25mg/ml。 （3）.標準胎牛血清：3次100納米過濾，低內毒素， 低血紅蛋白含量。 （4）.活性碳/葡聚糖處理血清：激素含量大大降低。 （5）.透析型胎牛血清：次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 8. 其他細胞培養用液：除培養基、血清、*外，其他幾種液體也屬必須，不可省略。 （1）.雙抗：200倍，（1ml/支）其終濃度為*100U/ml；*100ug/ml，-24 oC保存。 （2）.L-*：100倍，（1ml/支）， 終濃度2mM，-24 oC保存。 （3）.丙酮酸鈉：配制濃度50mM，4ml/支，終濃度為1mM/ml， -24 oC保存。 （4）.Hepes液：配制濃度1M（5ml/支），一支Hepes加入到200ml *培養基中，終濃度為25mM/ml，常溫保存。 9.支原體污染及檢測： （1）.支原體污染在細胞培養中zui常見、不易被查覺，但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結果。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的zui小微生物，它無細胞壁，形態呈高度多形性，zui小直徑0.2um，可通過濾器。 目前中心通過對國內100余株/系細胞的檢測，形勢不容樂觀。污染率達30% ~ 60% 。課題組從國外引進細胞株/系也經常出現支原體的污染。支原體在污染細胞后，它通過影響細胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養基中的氨基酸來抑制細胞的生長，并能降低細胞的融合率。因此，在運用各種細胞系進行實驗研究時，首先要證明所用細胞有無支原體的污染。 （2）.支原體污染后，培養基可不發生渾濁，細胞病變輕微或不明顯，因此難以發現。目前，支原體檢測的方法有以下幾種。 （a）.相差顯微鏡觀察；（b）.低張處理地衣紅染色法； （c）.熒光染色法；（d）.酶標法； （e）.PCR法：基礎醫學細胞中心使用該方法進行檢測。 優點：靈敏度高，檢測耗時短，樣品量小 （只需50ul細胞培養用液上清）。 |
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