農桿菌介導人胰島素ELISA法檢測研究
農桿菌介導轉化其轉化效率受到多種因素影響。隨機挑選5個抗性菌落進行驗證，PCR檢測結果表明，人胰島素基因已經整合到銀耳基因組中；RT-PCR結果顯示，在銀耳細胞中可以檢測到人胰島素基因的mRNA；Southern雜交結果表明人胰島素基因以單拷貝的形式整合到銀耳基因組DNA中。本試驗通過設置農桿菌與銀耳芽孢不同共培養時間、誘導劑乙酰丁香酮的濃度、銀耳芽孢及農桿菌濃度等因素對轉化效率影響，結果在乙酰丁香酮濃度為500μmol/mL、銀耳芽孢濃度為108個/mL、農桿菌OD=0.5及共培養時間為2d時，轉化效率zui高，為310個轉化子/108個銀耳芽孢。轉化子轉接5代后對潮霉素仍有抗性，說明外源基因在銀耳芽孢中能夠不亂遺傳。在實驗室已初步建立的農桿菌EHA105介導銀耳轉基因方法的基礎上，以銀菌株Tr21-01為出發菌株，通過凍融法將攜帶有潮霉素磷酸轉移酶(Hph)基由于遺傳標記及人胰島素基因(BAC)為目的基因的質粒pBHg-BCA導入根癌農桿菌GV3101，LBA4404和AGL-1中，并進一步介導轉究。實驗結L-1具有較高的轉化率；GV3101轉化率較低，且假陽性較高；LBA4404無抗性菌落長出。此結果表明不同的農桿菌侵染銀耳芽孢能力具有差異性，且對受體侵染具有一定的特異性。本實驗以農桿菌EHA105為參照菌株，對農桿菌AGL-1介導轉化銀耳進行研究。基于農桿菌介導轉基因受諸多因素的影響，本實驗從農桿菌與銀耳芽孢共培養時間、銀耳芽孢濃度、農桿菌濃度、誘導劑乙酰丁香酮(AS)的濃度、轉率等方面進行優化。其轉化前提優化結果為：AGL-1菌液OD值為0.4～0.5，AS誘導培養濃度為250μg/mL、共培養濃度為150μ耳芽孢濃度為10~8/mL，共培養72h轉化率zui高，可達500個/10~8，且陽性菌落為89%；EHA105菌液OD值為0.4～0.5。
