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錯(cuò)配修復(fù)基因檢測(cè)細(xì)胞衰老

時(shí)間：2016/8/8閱讀：1273

錯(cuò)配修復(fù)基因超家族屬于管家基因，目前已發(fā)現(xiàn)人類6個(gè)錯(cuò)配修復(fù)基因：hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2。錯(cuò)配修復(fù)基因的異常表現(xiàn)為基因突變和蛋白質(zhì)表達(dá)的減步，而蛋白質(zhì)表達(dá)涉及RNA水平和蛋白質(zhì)水平。下面就RNA水平作一簡(jiǎn)要闡述。

錯(cuò)配修復(fù)基因mRNA原位雜交：

【材料】

蓋玻片、濕盒、雜交爐、PBS、SSC、預(yù)雜交液、BcIP／NBT。

【操作程序】

1．將細(xì)胞制成1~107／L細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液一滴接種于已消毒培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，加培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)。

2．將細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的蓋玻片取出0．01mol／L PBS漂洗3次，甲醇：丙酮(1：1)固定液固定10分鐘，PBS漂洗3次。

3．將制好的細(xì)胞片用10mg／ml蛋白酶K消化，37℃，10分鐘，PBS洗2次，每次2分鐘。

4．取200μl預(yù)雜交液95℃變性10分鐘，冰浴中驟冷，加樣于細(xì)胞標(biāo)本上．平放入密封濕盒．42℃孵育3小時(shí)。

5．標(biāo)記探針加于200μl預(yù)雜交液中，95℃變性10分鐘，冰浴中驟冷，加樣于細(xì)胞標(biāo)本上，平放入密封濕盒，42℃恒溫過(guò)夜。

6．依次用6 xSSC-45％甲酰胺洗10分鐘，2×SSC洗10分鐘×2次，0．2xSSC洗10分鐘×2次。

7．加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，37℃，4小時(shí)。

8．洗脫液洗10分鐘，加入BCIP／NBT顯色。鏡檢顯況，PBS沖洗，終止顯色。

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