1．準備好凝膠濾柱以便完成結合反應后用于分離標記抗體和游離的熒光色素。分離球形蛋白使用排除極限為20 000～50 000的凝膠介質和細粒級凝膠（直徑約50μm）。所需凝膠濾柱的大小可根據偶聯反應的總體積×20來確定。依據廠家說明準備好濾柱，用20倍柱床體積的PBS灌注濾柱，直至緩沖液水平剛好降至低于柱床頂部，關閉濾紙底部的閥門或用塑膜黏土（或parafilm）封閉底端以使濾柱不再流動。

2．用0.1mol/L的硼酸鈉或碳酸鈉配制濃度至少為2mg/ml的抗體溶液（pH9.0）。應避免引入含一級胺的外來分子。

3．用無水DMSO（優級純）溶解FITC或TRITC至1mg/ml。每次標記反應時新鮮配制。

4．每1ml蛋白溶液加50μl染液。染液須以每次5μl緩慢加入，加入時應輕輕地連續攪拌混勻。

5．置4℃避光反應1h。

6．加氯化銨至50mmol/L，室溫孵育2h。加入0.1％二甲苯氰和5％甘油。

7．通過凝膠過濾分離結合物與未結合的染料。小心地將偶聯反應產物加在濾柱頂部，打開閥門使抗體溶液流過濾柱直至剛好進入柱床。再小心地將PBS加在濾柱頂部并與緩沖液供應裝置連接。結合染料的抗體首先洗脫，通常可在室光下見到。

8．將洗脫液的結合物4℃貯存于避光容器，必要時加入0.02％疊氮鈉。

9．進行熒光素偶聯反應時，應通過測量495nm和280nm波長的吸光值計算熒光素和蛋白的比率，羅丹明的測量波長在550nm和280nm。熒光素的吸光值比例（496nm/280nm）應在0.3～1.0之間，羅丹明的吸光值比率（550nm/280nm）在0.3～0.7之間。低于上述比率將導致低信號，高比率則出現高背景。若比率太低，應使用低濃度抗體與高濃度染料重復結合；若比率太高，則可適當調整后重新標記，或通過DEAE離子交換層析柱進一步純化抗體。用10mmol/L 磷酸鉀（pH8.0）平衡并灌注濾柱，通過增加鹽濃度進行梯度洗脫。