如果將試劑盒剛從冰箱里面拿出來就立即使用的話，可能會影響ELISA試劑盒后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。建議：先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，ELISA試劑盒以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步(圖15-5)。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA試劑盒提高到新水平。
    在一步法測定中，應注意鉤狀效應(hookeffect)，類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。
(三)間接法測抗體
     間接法是檢測抗體zui常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由于不能與固相抗原結合，ELISA試劑盒在洗滌過程中被洗去。