正式試驗時，應別離以陽性對照與陰性對照操控試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證試驗成果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
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實驗條件的挑選
 

在ELISA中，進行各項試驗條件的挑選是很重要的，其間包含：
 

（1）酶標記抗體工作濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采納“方陣法”（包被物、待檢樣品的參閱品及酶標記抗體別離為不同的稀釋度）在正式試驗體系里準確地滴定其工作濃度。
 

（2）包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時刻及其蛋白量也有一定影響,一般多選用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，調查陽性標本的OD值。挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于大都蛋白質來說一般為1～10μg/ml。
 

（3）固相載體的挑選：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在運用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一試驗條件下進行反響，調查其顯色反響是否均一性，據此判明其吸附功能是否良好。
 

（4）酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選要求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應注意防護。有條件者應運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物效果一段時刻后，應參加強酸或強堿以終止反響。一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物運用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。