請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比釋），分別配制成5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制2,500 ng/ml標準品：取0.5ml （不要0.5ml ）5,000 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋（如：10 檢測溶液A /990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。

7、檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/LH2SO4）。

11、覆膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品

1、酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）

2、微量加液器及吸頭，EP管

3、蒸餾水或去離子水，濾紙標本的采集及保存

1、血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20 或-80 保存，但應避免反復凍融。

2、血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20 或-80 保存，但應避免反復凍融。

3、其它生物標本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20 或-80 保 存，但應避免反復凍融。

4、樣本處理：血清或血漿標本*稀釋200倍。標本使用0.02 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。

注：以上標本均應密封保存，4保存應小于1周，-20不應超過1個月，-80不應超過2個月;標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1、加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。

3、棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

4、每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。

5、棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6、每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

7、每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。

8、立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。

注：

1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內。*設置復孔進行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發;洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態;同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數。

5、試劑配制：Detection A及DetectionB在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。

7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。