方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

1、 包被：用0.05M PH9.ELISA試劑盒牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml.在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)。

2、 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。

3、 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml.37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

4、 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5、 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml.

6、 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA試劑盒檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，ELISA試劑盒以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

方法二 用于：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0、1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。

↓

加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)，洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)

↓

于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌，zui后一遍用DDW洗滌。

↓

其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6.

三、ELISA試劑盒器材

1、 試劑

(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

NaHCO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、ELISA試劑盒靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。