摘要：

CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學領域近十年zui熱門的兩大技術。現在，科學家們正在撮合它們聯姻。雖然CRISPR-Cas9和人類iPSC在實驗室中已經相當普及了，但二者相結合并沒有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個工具的專家，推出了在人類干細胞中使用CRISPR的基礎指南。這份指南對人iPSC和人胚胎干細胞同樣適用。

CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學領域近十年zui熱門的兩大技術。現在，科學家們正在撮合它們聯姻。

干細胞能夠分化成為機體內任何類型的細胞，既是研究人體早期發育的理想工具，也是細胞治療的寶貴資源。胚胎干細胞很適合臨床使用，但獲得這些細胞會破壞胚胎，有很大的倫理爭議。2006年日本科學家山中伸彌開發了一個變通方案，用逆轉錄病毒將四個轉錄因子（OSKM）引入特化的成體細胞，再將其重編程為誘導多能干細胞（iPSC）。這些細胞在實驗室中表現出與胚胎干細胞相當的能力，又避開了胚胎干細胞的倫理問題，在疾病模擬、藥物篩選和細胞治療中有著巨大的應用前景，被人們視為細胞療法的新希望。山中伸彌也因為iPS技術贏得了2012年的諾貝爾生理/醫學獎。

CRISPR是指規律成簇的間隔短回文重復，細菌通過CRISPR與內切酶Cas組成的防御系統對抗外來侵略者。CRISPR-Cas能根據向導RNA的指引切割入侵者的遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統發展成了強大的基因組編輯工具。該系統可以簡單地編輯任何基因組區域，據說新手可在一周內學會用CRISPR編輯傳統的永生細胞系（比如HeLa或HEK293）。此外，研究者們還在CRISPR的基礎上開發了調控基因表達的新工具。

人們普遍認為，iPS與CRISPR的結合會起到一加一大于二的效果。舉例來說，CRISPR用于人類iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者細胞的基因缺陷。雖然CRISPR-Cas9和人類iPSC在實驗室中已經相當普及了，但二者相結合并沒有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個工具的專家，推出了在人類干細胞中使用CRISPR的基礎指南。這份指南對人iPSC和人胚胎干細胞同樣適用。

基本工作流程

在人iPSC中用CRISPR編輯基因或者控制基因表達，你需要開啟兩條平行的任務線：1）培養充足且可靠的多能干細胞；2）針對目的基因設計20nt的向導RNA。

研究者們目前主要通過電穿孔遞送向導RNA和Cas9核酸酶，因為這種方法能在保證細胞存活的同時送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自動化的臺式系統，比如Lonza的Nucleofector系統和ThermoFisher的Neon系統。Gladstone心血管病研究所的博士后Mohammad Mandegar奉勸大家，如果不是高通量細胞篩選，請不惜一切代價避免慢病毒遞送，因為人多能干細胞似乎會天然沉默慢病毒送入的基因。

抗生素抗性可以幫助我們挑選經過編輯的克隆。研究者們一般將抗生素抗性、熒光報告基因和流式細胞儀結合起來，富集那些轉染成功的細胞，把它們鋪在單孔或多孔板上。通過追蹤細胞形態、多能性標志物和細胞分化能力可以評估細胞的多能性。專家建議每10-20代或者每次細胞操作之后進行核型分析，確保細胞的染色體數量正常。

iPS細胞系如今有許多購買渠道，各大實驗平臺和公司都提供有相應的服務。此外，iPS重編程方案也非常多。加州大學伯克利分校的細胞生物學家Dirk Hockemeyer表示，我們應當找到自己的方案，在開始CRISPR編輯之前一定要很好地掌握這些細胞。

人多能干細胞VS人腫瘤細胞系

專家們還建議，在著手iPSC之前先用人類癌細胞系試一試CRISPR-Cas9工具。在對iPSC動手的時候牢記一點：操作人iPSC更繁瑣、更講究也更加昂貴。

據介紹，有經驗的研究者用大約一個月的時間能學會基礎的人iPSC培養。由于新方案和試劑經常出現，操作這些細胞是一個不斷學習的過程，哈佛醫學院George Church實驗室的博士后Susan Byrne說。“我告訴本科生，如果在正確的指導下操作這些細胞，你們將在六個月內成為專家。但人們一開始總是低估了這種技術，”哈佛干細胞研究所的Chad Cowan補充道。

請記住，每一個干細胞系都是*的。這會影響細胞培養和向導RNA的效果 。“供體和重編程方法都會帶來變異，”Byrne說。“有時我們需要對特定干細胞系進行方案優化。”一般來說，就算細胞系很健康、實驗方案很，人iPSC和ESC的編輯效率也會比癌細胞系低十倍，Johns Hopkins大學醫學院的Linzhao Cheng指出。

深入了解你的基因

知己知彼，百戰不殆。了解你想要編輯的基因座，認識那些可能轉錄的序列，可以幫助你設計出編輯方案。舉例來說，有些基因在編輯之后仍能表現出一定的生物學活性。在這種情況下，你可能需要切割更大的區域，Byrne說。

選擇多個向導RNA并對它們進行測試。現在已經有很多軟件可以篩選向導RNA。不過，就算是特異性非常好的向導RNA也有可能效果不佳，甚至根本不起作用。造成這種情況的原因很多，比如你可能沒有足夠好的參考基因組。此外，你可能需要優化向導RNA的活性，加州大學圣地亞哥分校的生物工程師Prashant Mali說。他和George Church領導團隊在Nature Methods雜志上發表文章，向人們展示了獲得活躍向導RNA的通用設計規則。（更多詳細信息參見：遺傳學界大牛Nature子刊發布CRISPR-Cas9新工具）

將CRISPR應用到iPS細胞中去，可以實現個性化的干細胞治療，造福多種遺傳學疾病的患者。James Thomson與Murdoch兒童研究所（MCRI）合作，將重編程與CRISPR基因組編輯結合到一個步驟中，顯著縮短了生成基因校正干細胞的時間，是實現個性化細胞療法的重要一步。（更多詳細信息參見：干細胞成果：CRISPR與重編程的結合）

2014年11月，遺傳學大牛George M. Church領導的研究團隊在Nature Communications雜志上展示了CRISPR編輯iPS細胞的脫靶情況。他們對人iPS細胞進行CRISPR基因編輯，然后將全基因組測序和靶向深度測序結合起來，鑒定了Cas9編輯iPS細胞時的脫靶效應。研究指出，CRISPR編輯人類iPSC并沒有導致顯著的基因組改變或突變率提高，不過有一種單核苷酸變異（SNV）會影響Cas9的特異性。（更多詳細信息參見：遺傳學大牛文章：CRISPR編輯iPS細胞的脫靶情況）