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聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體,甲撐雙丙烯酰胺稱交聯(lián)劑,在水溶液中,單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝膠。在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中,需要有催化劑參加,催化劑包括引發(fā)劑和另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基,通過自由基的傳遞,使丙烯酰胺成為自由基,發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng),加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。凝膠的篩孔,機(jī)械強(qiáng)度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定。每100亳升 凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度,常用T%表達(dá);凝膠溶液中交聯(lián)劑 占單體和交聯(lián)體總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度,常用C%表示。a:丙烯酰胺克數(shù); b:甲撐雙丙烯酰胺克數(shù);m:緩沖液體積(毫升) 凝膠濃度過高時(shí),凝膠硬而脆,容易破碎;凝膠濃度太低時(shí),凝膠稀軟,不易操作。 交聯(lián)度過高,膠不透明并缺乏彈性;交聯(lián)度過低,凝膠呈糊狀。常用的引發(fā)劑和加速劑的聚丙烯酰胺凝膠電泳配制如下表: 聚合反應(yīng)催化劑配伍引發(fā)劑加速劑(NH4)2S2O8 TEMED (NH4)2S2O8DMAPN核 黃 素 TEMED
注:(NH4)2S2O8,過硫酸胺 TEMED:N,N,N,N'; DMAPN:β-二甲基胺基丙晴用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng);用核黃素引發(fā),需要強(qiáng)光照射反應(yīng)液, 稱光聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響:
1、大氣中氧能淬滅自由基,使聚合反應(yīng)終止,所以在聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣 隔絕。
2、某些材料如有機(jī)玻璃,能抑制聚合反應(yīng)。
3、某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度,如赤血鹽。
4、溫度高聚合快,溫度低聚合慢。 以上幾點(diǎn)在制備凝膠時(shí)必須加以注意。
聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度,它不防止對(duì)流減低擴(kuò)散的能力,而且因?yàn)樗哂腥?度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大 小和形狀,這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用,這里的凝膠并不僅是單純 的支持物,因此,在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外,還必須注意與凝膠本身有關(guān)的各種性質(zhì)(網(wǎng)孔的大小和形狀等)。可通過下式計(jì)算來選擇適當(dāng)?shù)哪z網(wǎng)孔。公式中:P為網(wǎng)孔平均直徑,C為多聚體濃度,d為該多聚體分子直徑(若不是卷曲的分 子應(yīng)為5A),K為常數(shù),K值取決于漲膠的幾何構(gòu)型,假如多聚體的鏈?zhǔn)且越朴谥苯?交聯(lián)的,則約為1.5根據(jù)此式,我們可以通過多聚體濃度C近似地計(jì)算出網(wǎng)孔直徑,例如已知多聚體濃度為5%,這樣的計(jì)算是粗略的,與實(shí)際情況有一定距離,有人測(cè)定了總濃度(T)為20%的丙烯酰胺液,在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在下,聚合后的網(wǎng)孔大小,發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關(guān),總濃度愈大,孔徑相應(yīng)變小,機(jī)械 強(qiáng)度增強(qiáng),與總濃度不變時(shí),甲叉雙丙烯酰胺(Bis)的濃度在5%時(shí)孔徑zui小,高于或 低于此值時(shí),聚合體孔徑都相對(duì)變大,凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個(gè)重要的參數(shù),它 往往決定了電泳的分離效果。經(jīng)過不斷的實(shí)踐,得到了如表3所示的經(jīng)驗(yàn)值,在一般情況下,大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)采用7.5%濃 度的凝膠,所得電泳結(jié)果往往是滿意的,因此稱由此濃度組成的凝膠為“標(biāo)準(zhǔn)凝 膠”。對(duì)那些用于重要研究的凝膠,是通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進(jìn)行預(yù)先試驗(yàn),以選出zui適凝膠濃度。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn): 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物,沒有或很少帶有離子的側(cè)基,因而電滲作用比較小,不易和樣品相互作用。 由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì),在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比,形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu),其空隙可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化,可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小,選擇合適的凝膠成分,使之既有適宜的空隙度,又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。一般說來,含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠,機(jī)械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物質(zhì),1萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠,而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠,大孔膠易碎,小孔膠則難從管中取出,因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增 加時(shí)可以減少雙含丙烯酰胺,以改進(jìn)凝膠的機(jī)械性能。 在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對(duì)熱穩(wěn)定。凝膠無色透明,易觀察,可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。 聚丙烯酰胺是比較純的化合物,可以精制,減少污染。