生物通報道 美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）和Pacific Biosciences的研究人員利用PacBio的單分子實時（SMRT）測序技術(shù)，解析了與腸桿菌（Enterobacteriaceae）相關(guān)的醫(yī)院獲得性感染中質(zhì)粒介導(dǎo)的抗生素耐藥性。這項成果發(fā)表在一期的《科學(xué)-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》上。
研究人員從2011年爆發(fā)“超級細(xì)菌”的NIH醫(yī)院中采集了革蘭氏陰性的腸桿菌分離株，并分析了其中含有抗生素耐藥性酶的質(zhì)粒。他們的研究結(jié)果顯示攜帶這些耐藥基因的背景質(zhì)粒的廣泛多樣性，且許多耐藥性相關(guān)的質(zhì)粒來自醫(yī)院環(huán)境內(nèi)或外的獨立來源。
zui近幾年，美國頻頻出現(xiàn)“超級細(xì)菌”感染。這種細(xì)菌名為抗碳青霉烯類腸桿菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，簡稱CRE），因?qū)μ记嗝瓜╊悘V譜抗生素具有*的耐藥性而得名。
為了鑒定腸桿菌攜帶的編碼碳青霉烯酶的質(zhì)粒，以及它們在細(xì)菌物種之間的移動，研究人員對臨床和醫(yī)院環(huán)境的腸桿菌分離株進(jìn)行了全基因組測序，如肺炎克雷伯菌，產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸桿菌，它們都含有一個或多個碳青霉烯耐藥的質(zhì)粒。
研究小組主要關(guān)注與碳青霉烯酶相關(guān)的耐藥性，這涉及到所謂的KPC基因。研究人員解釋道，2011年NIH臨床中心有18名患者感染腸桿菌，其中就攜帶了包含KPC的質(zhì)粒。
腸桿菌的碳青霉烯耐藥性也來源于另一種質(zhì)粒，它包含由NDM1基因編碼的碳青霉烯酶。文章的通訊作者之一，國家人類基因組研究所的Julie Segre解釋道，這種質(zhì)粒在東南亞較為普遍。在2011年爆發(fā)“超級細(xì)菌”后，NIH中心未檢測到這種質(zhì)粒。
在此次分析中，研究人員從NIH臨床中心的近1100名患者身上采集了樣本。這包括直腸、咽喉和/或腹股溝拭子，在2012-2013年期間從醫(yī)院的重癥監(jiān)護(hù)室和高危內(nèi)科病房的患者中采集（每周兩次），以及從其他病房中采集的監(jiān)控樣本（每月一次），和新入院患者的樣本。 
當(dāng)他們篩查超過14,200個患者樣本及數(shù)百個從醫(yī)院環(huán)境中采集的樣本時，研究小組追蹤到10名患者，攜帶了包含KPC陽性質(zhì)粒的腸桿菌。還有兩名患者在出院后被檢測出KPC腸桿菌呈陽性。
研究人員之前試圖利用短讀取（short-read）測序技術(shù)對含有KPC的質(zhì)粒進(jìn)行測序和追蹤，但遇到了一些問題。Segre解釋道，部分原因在于含有抗性基因的質(zhì)粒往往含有大的、移動的遺傳元件。
她指出，以這項研究中的碳青霉烯耐藥性質(zhì)粒為例，KPC基因的兩側(cè)伴有Tn4401轉(zhuǎn)座子，伸出去多達(dá)10,000個堿基。因此，在試圖鑒定每個細(xì)菌細(xì)胞中的多個質(zhì)粒時就面臨挑戰(zhàn)。為了解決這個問題，研究人員決定利用PacBio的RSII系統(tǒng)來產(chǎn)生單分子的長讀取，這讓他們能夠同時查看細(xì)菌基因組的序列和質(zhì)粒的序列。
利用這種方法，他們對2012-2013年鑒定出的12名KPC陽性患者的分離株進(jìn)行了測序，同時對2011年爆發(fā)期間采集的2個分離株和醫(yī)院內(nèi)的6個環(huán)境監(jiān)控樣本進(jìn)行了測序。生物通 www.ebiotrade.com 
總的來說，這些序列代表了克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和泛菌屬（Pantoea）的物種，以及大小在9,300和379,000個堿基的質(zhì)粒，這讓研究團(tuán)隊能夠鑒定潛在的傳播事件。
研究人員發(fā)現(xiàn)，根據(jù)共同的遺傳特征，2012-2013年僅有1個病例可與2011年的爆發(fā)直接關(guān)聯(lián)。相反，研究結(jié)果表明，許多碳青霉烯耐藥性質(zhì)粒是在各中心獨立引入的，與早期感染沒有明確的流行病學(xué)。讓人意外的是，序列數(shù)據(jù)還說明耐藥質(zhì)粒很少發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。
盡管質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移不如預(yù)想中常見，但也有證據(jù)表明它在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中發(fā)生。Segre解釋道：“我們沒有在患者中觀察到，但我們確實在[醫(yī)院]環(huán)境中觀察到。”這種模式引發(fā)了人們對促進(jìn)或阻礙質(zhì)粒在不同微生物之間移動的機(jī)制的思考，這也是Segre及其同事后續(xù)研究的方向。
“我們?nèi)匀豢吹竭@些質(zhì)粒在移動，”Segre說，并指出基因組學(xué)研究“讓我們能夠開展我們想做的基礎(chǔ)生物學(xué)實驗”來了解這些過程。
研究人員也在嘗試模擬醫(yī)院生物膜的情況，以便弄清楚哪些情況可能會促使含KPC的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個新的微生物宿主。“我們?nèi)缃衲茉?測序基因組的背景下開展研究，因為我們了解每一個質(zhì)粒和它所攜帶的，”Segre解釋道。
在NIH臨床中心，研究人員還在繼續(xù)對新入院的患者以及重癥監(jiān)護(hù)室和其他病房中的患者進(jìn)行積極監(jiān)控。
對于目前的研究，每個樣本的測序價格大約是1200美元，但Segre指出，一旦所有質(zhì)粒的完整參考基因組都產(chǎn)生，還是能夠在高通量的短讀取儀器上開展更經(jīng)濟(jì)的測序。
為此，她和她的同事正著手建立一套質(zhì)粒參考基因組，作為國家監(jiān)控工作的一部分，旨在遏制抗生素耐藥性在醫(yī)院內(nèi)外的擴(kuò)散。

方法(09-18)原文檢索
Single-molecule sequencing to track plasmid diversity of hospital-associated carbapenemase-producing Enterobacteriaceae
Sci Transl Med 17 September 2014: 
Vol. 6, Issue 254, p. 254ra126 
Sci. Transl. Med. DOI: 10.1126/scitranslmed.3009845

來源：生物通