1試劑的因素

1.1試劑的選擇

　　試劑的選擇是保證血液檢測質量的關鍵要素。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴格把關，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在差異。要選購度相對高、具有“三證”的試劑，不要用無批號的試劑，選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。

　　1.2試劑的準備　　

    在臨床實驗室，對試劑的準備一般不太注意，通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此，在ELISA測定中試劑的準備zui為關鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20～30 min后，再進行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應微孔內的溫度較快地達到所需的溫度，以滿足后面的測定需求。

2樣本的因素　　

    2.1內源性干擾因素 　　

    包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等[1]。

　　2.1.1類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF)，其一般為IgM型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產生非特異結合的特點，因為在ELISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合，從而出現假陽性結果。避免其發生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG。②標本用聯有熱變性IgG的固相吸附劑處理。③檢測抗原時，可用2-巰基乙醇加入到標本稀釋液中使RF降解。
　　2.1.2補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系統的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結合過程中抗體分子發生變構，使Fc段的補體C1q結合點暴露出來，使C1q成為一個中介物將二者交聯起來出現假陽性結果。另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體和抗原的表位結合能力而引起假陰性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本。②56℃ 30 min加熱血清使C1q滅活[1，2]。

　　2.2外源性干擾因素　　

    包括標本溶血、標本被細菌污染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。

　　2.2.1標本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶(HRP)為標志的ELISA測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。所以在采血時應注意手法，采集的血液勿用力振蕩，嚴防標本溶血。
　　2.2.2標本的污染菌體可能含有內源性辣根過氧化物酶，可使實驗出現非特異性顯色。因此，ELISA檢測宜采集新鮮標本，如不能當時測定，5 d之內應4℃保存，1周后檢測應低溫凍存；同時，收集標本采用無菌試管，可防止標本的污染。
　　2.2.3標本的保存標本在冰箱中保存過久，血清中IgG可聚合成多聚體，AFP可形成二聚體，在用間接法測定中會導致本底過深，甚至造成假陽性。冰凍保存的標本反復凍融產生機械剪切力對標本中的蛋白等分子有破壞作用，可引起假陰性結果。因此，ELISA檢測盡量采用新鮮標本，長時凍存的樣本避免反復融凍[3]。
        2.2.4標本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原，可使結果呈假陽性。解決的方法有：①于*中加入適當的抗凝劑；②將采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h，待充分凝固后再離心分離血清[4]。

3操作中的因素　　

    3.1加樣  孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準，都可導致試驗結果不準確。控制方法：①實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，并經常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。

　　3.2溫育  溫育是ELISA測定zui為關鍵、zui容易出現問題的步驟。zui為常見的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。目前國內售ELISA試劑盒溫育時間為37℃，30 min~1 h，進口ELISA試劑盒則通常為37℃，1～2 h能有較*的結合。

　　3.2.1溫育時間、溫度的選擇一般根據試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃需要一定時間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠，易致弱陽性標本測不出來。控制方法：①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件；②用1個小溫度計放置在板孔反應液中測量觀察。
　　3.2.2 “邊緣效應”的排除“邊緣效應”是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現象。產生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的，因此在溫育時盡量采用水浴。

　　3.3洗板 　ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動洗板機時，洗液量不足導致洗板不*，洗板針堵塞導致抽吸不*，洗板不暢導致清洗效果差。控制方法：①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；③為了洗滌效果好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1～2次，或適當增加洗板的次數，有資料報道洗板7次能達到理想的洗滌效果[5]。

　　3.4顯色 　市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應盡量避免接觸金屬器械。

　　3.5結果判定

讀取結果要在15～30 min內完成，定性測定用肉眼判讀試驗結果時，反應板應水平距離白色背景10~15 cm；定量測定時用酶標儀讀取結果，酶標儀不應置于陽光或強光照射下，需先預熱15～30 min再進行測試。
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