*節 概  述

在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA.

轉化（Transformation）是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2，RbCl（KCl）等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞（Compenent cells）。進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子（Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞）。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl） 法，RbCl（KCl）法制備的感受態細胞轉化效率較高，但CaCl2法簡便易行，且其轉化效率*可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌，gan，，油，于-70℃保存（半年），因此 CaCl2法為使用更廣泛。

為了提高轉化效率， 實驗中要考慮以下幾個重要因素：

1. 細胞生長狀態和密度：不要用經過多次轉接或儲于4℃的培養菌，從-70℃或-20℃，gan，油，保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5×107個/ml左右（不同的菌株情況有所不同），這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。

2. 質粒的質量和濃度：用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA（cccDNA）。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%。

3. 試劑的質量：所用的試劑，如CaCl2等均需是zui高純度的（GR.或AR.），并用超純水配制，分裝保存于干燥的冷暗處。

4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，tip頭等是新的，并經高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

本實驗以E.coli DH菌株為受體細胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態，然后與pBS質粒共保溫，實現轉化。由于pBS質粒帶有氨芐*抗性基因（Ampr），可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。
第二節 材料、設備及試劑

一、材料

E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ；pBS質粒DNA：購買或實驗室自制，eppendorf管。

二、設備

恒溫搖床，電熱恒溫培養箱，臺式高速離心機，無菌工作臺，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機，分光光度計，微量移液槍。

三、試劑

1.LB固體和液體培養基。

2.Amp母液。

3.含Amp的LB固體培養基：將配好的LB固體培養基高壓滅菌后冷卻至60℃左右，加入Amp儲存液，使終濃度為50ug/ml，搖勻后鋪板。

4.麥康凱培養基（Maconkey Agar）：取52g麥康凱瓊脂，加蒸餾水1000ml，微火煮沸至*溶解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp儲存液使終濃度為50ug/ml，然后搖勻后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液：稱取0.28g CaCl2（無水，分析純），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌。

6.含15%，gan，油，的0.05mol/L CaCl2：稱取0.28g CaCl2（無水，分析純），溶于50ml重蒸水中，加入15ml，gan，油，定容至100ml，高壓滅菌。

第三節 操作步驟

一、受體菌的培養

從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落，接種于3-5ml LB液體培養基中，37℃下振蕩培養12小時左右，直至對數生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養2-3小時至OD600 =0.5左右。

二、感受態細胞的制備（CaCl2 法）

1、將培養液轉入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000g離心10分鐘。

2、棄去上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30分鐘后，4℃下3000g離心10分鐘。

3、棄去上清，加入4ml預冷含15%，gan，油，的0.05mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液。

4、感受態細胞分裝成200μl的小份，貯存于-70℃可保存半年。
三、轉化

1、從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

2、加入pBS質粒DNA溶液（含量不超過50ng，體積不超過10μl），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。

3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。

4、向管中加入1ml LB液體培養基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。

5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液*被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16-24小時。

同時做兩個對照：

對照組1： 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。

對照組2：以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。

四、計算轉化率

統計每個培養皿中的菌落數。

轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：

轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/涂板菌液體積

轉化頻率（轉化子數/每mg質粒DNA）=轉化子總數/質粒DNA加入量（mg）

感受態細胞總數=對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/涂板菌液體積

感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數

[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板，而有的轉化效率低，涂板時必須將菌液濃縮（如離心），才能較準確的計算轉化率。上海友騰生物傾力為客戶提供上萬種科研試劑，提供*、zui全、zui有效的科研試劑產品，質量被全國各大院校科研機構認可。同時代理IBL，DRG ，R&D，HCB等品牌*試劑盒。