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上海哈靈生物科技有限公司
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3-磷酸甘油醛脫氫酶活性終點比色法定量檢測試劑盒
2022-10-31 閱讀(262)
主要用途
3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性終點比色法定量檢測試劑是一種旨在通過3-磷酸甘油磷酸激酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中，伴隨的還原腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞、組織、血液等裂解懸液樣品3-磷酸甘油醛脫氫酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase；GAPDH；EC1.2.1.12）是一種四聚體的酶蛋白，參與催化糖酵解，分解葡萄糖分子，為機體提供能量和碳分子。同時具有轉(zhuǎn)錄激活、凋亡啟動等功能。3-磷酸甘油醛脫氫酶存在于所有生物體的細胞漿中，而作為看家基因，常用于RNA和蛋白表達分析的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。通過3-磷酸甘油磷酸激酶（3-phosphoglyceric phosphokinase；3-PGK）和3-磷酸甘油醛脫氫酶酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，首先底物3-磷酸甘油（3-phosphoglyceric acid；3-PGA）受到3-磷酸甘油磷酸激酶催化磷酸化反應(yīng)，產(chǎn)生1,3-二磷酸甘油（glycerate-1,3-diphosphate）；進而由3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用，產(chǎn)生3-磷酸甘油醛（Glyceraldehyde-3-Phosphate；G-3-P），同時其輔酶因子還原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；β-NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；β-NAD），通過測定吸光值的變化（340nm 波長），來定量分析3-磷酸甘油醛脫氫酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
3-PGK
3-phosphoglyceric acid + ATP → glycerate-1,3-diphosphate + ADP
GAPDH
glycerate-1,3-diphosphate + β-NADH → glyceraldehyde-3-phosphate + β-NAD + Pi
產(chǎn)品內(nèi)容
緩沖液（Reagent A） 5毫升
反應(yīng)液（Reagent B） 500微升
底色液（Reagent C） 500微升
陰性液（Reagent D） 500微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）和底色液（Reagent C）避免光照；有效保證6月
用戶自備
96孔板：用于比色的容器
酶標(biāo)儀：用于樣品比色分析
實驗步驟
一、 測定準(zhǔn)備
1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent C）避免光照
3． 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
二、 活性測定
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
2． 分別移取75微升緩沖液（Reagent A）到96孔板里
3． 分別加入10微升反應(yīng)液（Reagent B）
4． 分別加入10微升底色液（Reagent C）
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在25℃溫度下孵育3分鐘
7． 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動96孔板
9． 在25℃溫度下孵育10分鐘
10． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測
11． 活性計算
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 10（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾3-磷酸甘油醛/分鐘
注意事項
1． 本產(chǎn)品為50次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關(guān)重要
5． 孵育完成后即刻比色測定
6． 測定值由高到低變化；測定持續(xù)10分鐘
7． 樣本測定10分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8． 比色測定后，比色皿須清洗
9． 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）
10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
11． 3-磷酸甘油醛脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾3-磷酸甘油至3-磷酸甘油醛所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化經(jīng)典分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
