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主要用途

細(xì)胞二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶-1（Diacylglycerol acyltransferase-1；DGAT1）活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在運(yùn)用油酰和二酰基甘油作為底物，在DGAT2抑制劑的存在下，通過(guò)轉(zhuǎn)移酶的催化，釋放出巰基，進(jìn)而使用Ellman試劑，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用光度法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液、微粒體，或純化酶樣品二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶-1的活性檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase；DGAT；EC2.3.1.20），又稱為酰基二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl-CoA:1,2-diacylglycerol acyltransferase）或甘油三酯合成酶（triglyceride synthetase），存在于哺乳動(dòng)物、植物、真菌/酵母和細(xì)菌等生物體內(nèi)，主要位于微粒體內(nèi)的膜結(jié)合型蛋白，尤其在脂肪組織高度表達(dá)，是甘油三酯生物合成（Kennedy）通路中的終端步驟。催化由酰基上的脂肪酸轉(zhuǎn)移到二酰基甘油分子sn-3部位上的酰化反應(yīng)（acylation），產(chǎn)生甘油三酯。且通過(guò)變構(gòu)調(diào)理（allosteric modulation）和二價(jià)修飾（covalent modification）等調(diào)節(jié)。甘油三酯是中性脂質(zhì)，無(wú)極性，不溶于水，是組織細(xì)胞能量?jī)?chǔ)存的一種形式。甘油三酯是導(dǎo)致肥胖癥的重要原因，而高甘油三酯血癥（hypertriglyceridemia）是心血管疾病的的危險(xiǎn)因子，由此降低甘油三酯水平成為藥物研究的重要課題，其中二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶成為藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)，以達(dá)到降低甘油三酯水平，同時(shí)降低血漿中極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白（VLDL/LDL）含量。二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶有2種同工酶：DGAT1和DGAT2。它們沒(méi)有序列同源性，但催化類似的反應(yīng)。DGAT1是肥胖癥的治療目標(biāo)。基于底物油酰（oleoyl CoA）和二酰基甘油，在DGAT2敏感性抑制劑（niacin）存在的情況下，通過(guò)二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1的催化，產(chǎn)生甘油三酯，并釋放出巰基（CoA-SH），進(jìn)而與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過(guò)其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

              DGAT1

Oleoyl-CoA  +  1,2-diacyl-sn-glycerol     →   triglyceride   +   CoA-SH

 DTNB  +   CoA -SH  →   TNB  +  CoA -S-S-TNB

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        120毫升

裂解液（Reagent B）         12毫升

緩沖液（Reagent C）          6毫升

反應(yīng)液（Reagent D）        500微升

底物液（Reagent E）          1毫升

陰性液（Reagent F）          500微升

顯色液（Reagent G）             200微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)                1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管——此為總蛋白樣品

15． （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g

16． （選擇步驟）小心抽去上清液

17． （選擇步驟）加入100微升裂解液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群——此為微粒體樣品

18． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

19． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，并置零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）避免光照

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 樣品背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取135微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升底物液（Reagent E）

3． 加入20微升陰性液（Reagent F）

4． 加入20微升待測(cè)樣品（500微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在37℃溫度下孵育30分鐘

7． 加入5微升顯色液（Reagent G），混勻

8． 在37℃溫度下孵育5分鐘

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品背景對(duì)照 

四、 樣品活性測(cè)定

1． 移取135微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入20微升底物液（Reagent E）

4． 加入20微升待測(cè)樣品（500微克總蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在37℃溫度下孵育30分鐘

7． 加入5微升顯色液（Reagent G），混勻

8． 在37℃溫度下孵育5分鐘

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù) 

五、計(jì)算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.20（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾巰基/分鐘

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景對(duì)照和樣品活性

2． 分別移取135微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔里

3． 加入20微升陰性液（Reagent E）到樣品背景對(duì)照孔里

4． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent D）到樣品活性孔里

5． 分別加入20微升底物液（Reagent E）到所有孔里

6． 分別加入20微升待測(cè)樣品（500微克總蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動(dòng)96孔板

8． 在37℃溫度下孵育30分鐘

9． 分別加入5微升顯色液（Reagent G）到所有孔里

10． 輕輕搖動(dòng)96孔板

11． 在37℃溫度下孵育5分鐘

12． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得背景和樣品活性讀數(shù)

13． 活性計(jì)算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.20（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.5（光徑距離；厘米）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾巰基/分鐘

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 建議使用微粒體樣品取代總蛋白樣品，避免干擾

4． 樣本背景和樣品活性測(cè)定需要平行測(cè)定

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 測(cè)定值由低到高變化

7． 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*

8． 反應(yīng)時(shí)間持續(xù)30分鐘

9． 建議待測(cè)樣本為總蛋白，其蛋白濃度為500微克/20微升；如果為微粒體蛋白樣品，其蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

10． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

11． 用戶可以使用二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶-1抑制劑(1R,2R)-2-[[4'-[[Phenylamino)carbonyl]amino] [1,1'-biphenyl]-4-yl]carbonyl]cyclopentanecarboxylic acid（IC50=24納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

12． 二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶-1單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)釋放1微摩爾巰基所需的酶量作為一個(gè)活性單位

13． 本公司提供系列二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感