美國華盛頓大學等機構(gòu)的研究人員對蛋白降解過程中磷酸化與泛素化的交互應答進行了整體分析，發(fā)現(xiàn)不同的磷酸化位點往往同時發(fā)生泛素化。這項研究成果于近期在線發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。
蛋白的翻譯后修飾（PTM）功能作為高度靈活的開關(guān)，調(diào)控著蛋白活性、濃度以及亞細胞定位。蛋白的一個或多個殘基可被修飾，賦予特定的蛋白調(diào)控。然而，蛋白的翻譯后修飾存在交互應答（cross-talk），即一種修飾的存在會影響其他的出現(xiàn)，這種現(xiàn)象的基礎(chǔ)仍然不明。
真核生物蛋白質(zhì)組中存在兩種zui普遍的翻譯后修飾，磷酸化和泛素化，它們在幾乎每個細胞過程中都是*的。磷酸化是調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導的主要機制，而泛素化在蛋白降解中發(fā)揮了重要的作用。磷酸化和泛素化之間的交叉調(diào)控可采取很多形式。
然而，到目前為止，大部分研究都只關(guān)注一種類型的修飾，這主要是鑒于兩方面的限制。首先，修飾往往以低于化學計量的水平存在，需要高度特異的富集方法。其次，蛋白質(zhì)組學通常在肽段上開展，而不是完整的蛋白，這種實驗通常切斷了單個蛋白異形體上多種修飾之間的關(guān)聯(lián)。為此，華盛頓大學基因組科學系的Danielle Swaney等研究人員開發(fā)出兩種富集策略，實現(xiàn)了共修飾蛋白的整體鑒定，并應用這些方法來研究蛋白降解背景下泛素化與磷酸化之間的交互應答。
在*種富集方法中，研究人員應用鈷-NTA親和純化來富集釀酒酵母中經(jīng)泛素（帶His標簽）修飾的蛋白。這種泛素富集后的群體稱為泛素化蛋白，而穿流液則被稱為未泛素化的蛋白。經(jīng)過*消化后，他們富集了這兩部分蛋白中的磷酸化肽段。此外，為了鑒定泛素化蛋白中的單個泛素化位點，他們使用抗體來富集消化后泛素化的賴氨酸殘基上仍存在*-*（diGly）的肽段。之后，他們利用納米反向液相色譜（nRPLC）偶聯(lián)串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）來分析這三種樣品（未泛素化的磷酸化肽段、泛素化的磷酸化肽段以及泛素化的未磷酸化肽段）。第二種方法則是直接鑒定同時存在磷酸化和泛素化修飾的肽段。研究人員首先用*將蛋白消化成肽段，隨后利用強陽離子交換（SCX）層析來富集帶雙電荷的肽段。之后通過抗體對SCX組分進行進一步富集，并通過nRPLC偶聯(lián)MS/MS分析。
通過這兩種方法，研究人員鑒定出466個同時經(jīng)泛素化和磷酸化修飾的蛋白。此外，他們應用這些方法來定量鑒定通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控蛋白降解的磷酸化位點。結(jié)果表明，不同的磷酸化位點通常也用于泛素化，且這些位點在整個磷酸化位點中更高度保守。zui后，研究人員還探討了磷酸化機制如何被泛素化所調(diào)控。
作者認為，翻譯后修飾的交互應答是一個復雜且多層面的問題，且大部分還有待探索。而一些新的蛋白質(zhì)組學技術(shù)，比如他們所使用的，如今提供了一種實用的方法，來鑒定修飾交互應答，并闡明其復雜性和影響力。
