*福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片的存檔代表了珍貴且來源廣泛的生物醫學研究材料。隨著越來越多的研究人員轉向FFPE樣品的分子分析，開發特定的操作步驟，考慮這些樣品的*性質就變得越來越重要。成功的FFPE樣品分子分析的關鍵因素
如前文所述，福爾馬林固定和石蠟包埋會損害從組織樣品中獲得的核酸質量。在本文中，我們解釋了FFPE樣品中的低質量分析物將如何負面影響FFPE樣品的分子分析，并就克服這一挑戰提出了一些必要措施。
1 RNA質量控制
在開展RNA樣品的質量控制時，通常測定的參數包括260 nm和280 nm的吸光度比值（對于10 mM Tris•Cl，pH 7.5中的純RNA，A260/A280比值在1.9-2.1）以及28S rRNA與18S rRNA的比值（2:1的比值意味著完整RNA）。通過毛細管電泳（如QIAxcel® System）分析RNA樣品，可指示RNA的片段化狀態（圖17）。QIAxcel實現了zui多96個RNA FFPE樣品的分析，而無需人工干預。它的分析比其他質量控制系統更快，操作也更簡單，因為它使用即用型的凝膠卡夾。
圖17. 來自FFPE樣品的RNA的質量控制分析。大鼠腎臟樣品經過福爾馬林固定和石蠟包埋。在包埋后立即切片（上圖），或保存12個月后再切片（下圖）。利用RNeasy FFPE Kit純化總RNA。純化后的RNA在A QIAxcel或B Agilent 2100 BioAnalyzer上分析。
Agilent 2100 Bioanalyzer等系統還產生RIN（RNA完整性系數）或類似值，從1到10。RIN值為10表明高度完整的RNA，而RIN值為1則表明高度片段化的RNA。盡管這些參數給出了RNA純度和完整性的概念，但沒有提供化學修飾方面的信息。如上文所述，福爾馬林固定引入了分子之間的交聯，而甲醛對RNA的修飾會損害下游的酶學分析，如RT-PCR（圖18）。
圖18. 福爾馬林固定和石蠟包埋對RT-PCR效率的影響。各種大鼠組織經過福爾馬林固定和石蠟包埋。在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后，利用RNeasy FFPE Kit純化RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析RNA完整性，RIN值如圖所示，電泳峰圖詳見圖4。純化后的RNA用于一步法RT-PCR，使用的是QIAGEN OneStep RT-PCR Kit和大鼠Hprt1基因的不同引物對，產生了128、208、404和669 nt的擴增子。RT-PCR也利用新鮮組織的RNA開展，作為陽性對照，并開展無模板RT-PCR，作為陰性對照。結果表明，FFPE樣品中較長擴增子的擴增受損。此外，PCR表現與RNA完整性不相關。這是因為，對于大部分樣品，甲醛對RNA的化學修飾是限制因素，而非RNA段長度。（數據引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）。
因此，來自FFPE樣品的RNA質量的評估應包含一套RT-PCR分析，以確定擴增子大小的上限?；蛘撸瑢τ趏ligo-dT靶定的cDNA，可利用不同引物對開展實時定量RT-PCR分析，以產生相似大小的擴增子，它們距離RNA轉錄本的3’端越來越遠。擴增反應的成功程度將指示整個轉錄本中RNA降解的程度。由于oligo-dT靶定不建議用于FFPE樣品的RNA，故*種方法是。
至于Agilent 2100 Bioanalyzer上高度片段化RNA樣品的分析，根據我們的經驗，RIN值為4或以下不能提供太多信息或重復。對于高度降解的RNA，我們認為，使用峰片段長度（它可從峰圖中推導出）作為RNA完整性的度量。
2 通過PCR和實時定量PCR開展DNA分析
正如前文所述，由于福爾馬林交聯的引入，FFPE樣品中的基因組DNA常常嚴重片段化并修飾。QIAamp DNA FFPE Tissue Kit對基因組DNA的純化確實會逆轉一些交聯，但其他交聯是不可逆轉的，在純化后仍然存在。因此，需要一個可靠的PCR系統，來擴增這種困難的模板類型。既然只有一部分起始模板可以擴增，那么PCR高靈敏度和特異性才是FFPE樣品成功檢測的前提。HotStarTaq® DNA Polymerase和HotStarTaq Plus DNA polymerase再加上QIAGEN*的PCR Buffer，為這種類型的起始模板提供了高度靈敏的PCR。此外，在開展FFPE樣品的基因組DNA的PCR或實時定量PCR分析時，我們強烈建議設計盡可能短的擴增子。
3 通過實時定量RT-PCR開展基因表達分析
基因表達的分析可通過實時定量RT-PCR來實現，其中從樣品中純化得到的RNA先通過逆轉錄轉化成cDNA，之后可實時擴增和檢測所需的cDNA目標。
如果實時定量RT-PCR的引物能擴增cDNA和基因組DNA序列，那么RNA樣品中基因組DNA污染的存在會影響基因表達分析的準確性。因此，必須避免基因組DNA污染，以保證準確的結果。利用RNeasy FFPE Kit、miRNeasy FFPE Kit或AllPrep DNA/RNA FFPE Kit純化RNA，可實現這一點，它們包含了一個步驟，可從分離的RNA中去除痕量的小片段基因組DNA。此外，實時定量RT-PCR也可作為兩步法應用開展，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit進行cDNA合成，接著利用QuantiFast PCR Kit進行擴增。在cDNA合成過程中，QuantiTect Reverse Transcription Kit通過新穎的gDNA Wipeout技術去除基因組DNA污染。另外，實時定量RT-PCR也可作為一步法應用開展，使用QuantiFast® Probe RT-PCR Plus Kit，它在實時定量RT-PCR開始之前去除基因組DNA污染。有了QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit，所獲得的CT值明顯高于其他方法，那些方法依賴基因組DNA的含量和基因表達的水平。這并不是因為試劑盒的PCR靈敏度較低，而是它只檢測cDNA，而不是cDNA和基因組DNA（圖19）。
圖19. 基因組DNA的去除帶來準確的基因表達分析。利用RNeasy FFPE Kit，從人的乳腺、肝臟或腎臟FFPE樣品中純化總RNA。對多個表達水平不同的不同目標開展雙重、實時定量RT-PCR，帶有（+RT）或不帶（-RT）逆轉錄步驟，使用的是QuantiFast Probe Assays（FAM™標記）和A QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit或B 另一個多重PCR試劑盒，不包含gDNA去除步驟。所有反應在ABI StepOnePlus™循環儀上開展。A -RT樣品的高CT值表明無擴增，且不存在基因組DNA污染。因此+RT樣品所獲得的CT值反映了可靠且準確的RNA檢測。目標12（TUSC2）和13（EZH2）不表達。這些結果表明，QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit有效去除了基因組DNA。B -RT和+RT樣品的CT值相似說明了基因組DNA污染可檢測到，讓這些結果不可靠。
在逆轉錄反應中，zui常用的引物是隨機六聚體或oligo-dT引物。然而，這些引物并不適用于FFPE組織中化學修飾和片段化的RNA。使用oligo-dT引物時，逆轉錄從mRNA轉錄本的poly-A尾巴開始。因此，如果RNA嚴重片段化或被甲醛修飾，那么只有對應于轉錄本3’端的cDNA才能合成。隨機六聚體更為合適，特別是對于表達譜研究（如芯片分析）。不過它們也有限制，特別是研究單個基因的表達時。只有與目的擴增子相近的隨機六聚體才能產生實時定量PCR分析所需的cDNA目標。由于這些六聚體只占逆轉錄反應中全部六聚體的一小部分，所以它們的起始效率非常低。
為了在實時定量RT-PCR中獲得*的結果，應當在逆轉錄步驟中使用與目的擴增子相近的基因特異引物?；蛘?，使用oligo-dT引物和隨機引物，如QuantiTect Reverse Transcription Kit一樣。此外，應設計實時定量PCR步驟的引物，讓擴增子盡可能短。如果選擇的擴增子長于將要擴增的RNA段，會導致不準確的結果。FFPE樣品中RNA段的大小通常在50-300 nt，大部分片段的大小在100 nt左右。QuantiFast Probe Assays是基于成熟的水解探針技術（5’ 核酸酶技術，如TaqMan®），利用算法而設計，通過探針型實時定量RT-PCR來實現FFPE樣品的基因表達分析。QuantiFast Probe Assays能夠擴增和檢測不超過100 bp的RNA和cDNA目標，效率和可靠性都很高（圖20）。
圖20. FFPE樣品中RNA的實時定量RT-PCR檢測。利用RNeasy FFPE Kit從乳腺組織FFPE樣品中純化得到總RNA（1 ng、100 pg、10 pg和1 pg）。在Rotor-Gene Q循環儀上擴增和檢測人MUC1基因的轉錄本，利用的是QuantiFast Probe RT-PCR Plus Kit和QuantiFast Probe Assay（藍色曲線）或供應商AII的預設計分析（紅色曲線）。與供應商AII的分析相比，QuantiFast Probe Assay的結果表現出較低的CT值和更高的靈敏度。利用QuantiFast Probe Assay可檢測低至1 pg的模板（利用供應商AII的分析無法檢測1 pg）。
FFPE樣品的珍貴性意味著只有少量RNA才能回收，這限制了實時定量RT-PCR分析的數量。在需要分析大量基因時，這可能是一個嚴重的問題。為了增加可供分析的cDNA量，可在逆轉錄和實時定量PCR之間引入一個預擴增步驟。通過RT2 FFPE PreAMP技術，在cDNA合成之后開展多重PCR，預擴增cDNA目標，這些目標來自特定通路或疾病狀態的基因。在預擴增之后，利用適當的RT2 Profiler PCR Array，每個cDNA目標可通過實時定量PCR單獨定量（圖21）。RT2 FFPE PreAMP技術不僅提高實時定量PCR分析的靈敏度，還保留了原始的基因表達譜。
圖21. cDNA目標預擴增之后的芯片分析。利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit從人乳腺FFPE組織中純化總RNA。隨后利用RT2 FFPE PreAMP技術對RNA進行逆轉錄。利用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array通過實時定量PCR開展基因表達分析，比較一個腫瘤樣品和一個非腫瘤樣品。ΔΔCT分析表明，腫瘤樣品與非腫瘤樣品的基因表達相差x倍。
4 利用焦磷酸測序開展甲基化和突變分析
焦磷酸測序是一種新穎的技術，實現了核苷酸序列的可靠測序以及目的序列內遺傳變異（如CpG位點的甲基化或突變）的靈敏、準確定量（圖22和23）。由于FFPE樣品中的DNA分子互相交聯，并與其他分子交聯，那么在焦磷酸測序分析之前必須去除這些交聯。使用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit（圖22）或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（圖23）從FFPE樣品中純化基因組DNA，可確保福爾馬林交聯的部分逆轉（一些交聯是不可逆的），為擴增和隨后的焦磷酸測序分析提供了適當的DNA模板。
圖22. 利用焦磷酸測序開展DNA甲基化分析。利用EpiTect Plus FFPE Bisulfite Kit從大鼠肝臟FFPE組織（10 μm）中純化DNA。利用PyroMark PCR Kit擴增APC基因上的3個CpG位點，并利用PyroMark Gold Q24試劑開展焦磷酸測序分析。峰圖顯示了可靠的焦磷酸測序長讀取以及每個CpG位點甲基化水平的靈敏定量（藍色背景）。以黃色高亮顯示的位點是對照位點，證明了DNA的*亞硫酸氫鹽轉化。
圖23. 利用焦磷酸測序開展突變分析。利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit從結腸癌FFPE組織中純化DNA。利用KRAS Pyro Kit開展焦磷酸測序，以便鑒定KRAS基因中的突變。A 一個密碼子12和13的基因型正常的樣品分析后的峰圖軌跡。B 一個密碼子12中第2位堿基發生GGT ? GAT突變的樣品分析后的峰圖軌跡
