1．石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應置 60℃ 1 小時） 。

       ① 二甲苯 、II，各 10 分鐘。
       ② 梯度酒精：100%，2 分鐘  95%，2 分鐘  80%，2 分鐘  70%  2 分鐘。
       ③ 蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

2．過氧化氫封閉內源性過氧化物酶：3%H₂ O₂ ，室溫 10 分鐘（避光） 。

3．蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

4．抗原修復：根據待檢測的抗原，選擇適當的方法。

附：抗原修復液（10mMpH 6.0 *緩沖液）的配制：① 儲備液的配制：A 液：枸櫞酸三鈉- 2H₂O 29.41g + 蒸餾水 1000ml；B 液：枸櫞酸 21g + 蒸餾水 1000ml；② 工作液的配制：A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸餾水 900ml

抗原修復的方法： ① 高壓鍋處理技術：*緩沖液（10mM，PH6.0），淹沒切片，蓋上鍋蓋，高壓鍋內煮沸，上汽 3 分鐘后緩慢冷卻（可用自來水在高 壓鍋外沖，以助冷卻） 。② 微波處理技術：用塑料切片架，置于塑料或耐溫玻璃容器內，枸櫞酸 鈉緩沖液淹沒切片，選擇中高或,5 分鐘;取出并補充已預熱的 *緩沖液； 再選擇中高或，5分鐘（.*溫度為 92 95℃）③ 酶消化處理。

抗原修復的注意事項：① 組織不能干。 ② 選擇抗原修復方法要因抗體而異。 ③ 該方法主要用于 10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。④ 抗原修復后至 DAB 顯色的過程中，均需用 PBS 緩沖液。

5．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

6．正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態,）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理，37℃，15 分鐘。

附：正常血清配制 （ 或按試劑盒規定的濃度配制）：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl （10%拋灑量） 計算。

7．滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時（也可置于 4℃冰箱過夜） 。

8．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

9．滴加*化的二抗，37℃，40 分鐘。

10．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

11．滴加三抗 （SAB 復合物） ，37℃，40 分鐘。

12．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

13．DAB 顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止） 。

附：DAB 的配制① 儲備液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H₂O ₂  5μl

14．自來水（細水）充分沖洗。

15．蘇木素復染，室溫，30 秒，自來水沖洗。

16．自來水沖洗返藍，15 分鐘。

17．梯度酒精脫水：80%，2 分鐘  95%，2 分鐘  100%，2 次，5 分鐘。

18．二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘

19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。