材料
瓊脂糖凝膠介質鎳親和柱
紫外檢測儀
蛋白電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液槽等附件
5 ml 注射器
0.45 μm 濾器
超聲破碎儀
試劑
1. 結合緩沖液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH=8.0
2. 洗脫緩沖液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，不同梯度濃度的咪唑，pH=8.0
3. 20%乙醇
4. 三蒸水
5. 透析液：20 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0
注：
純化所用所有試劑均用三蒸水進行定容，溶液配完后均用0.22 μm 濾膜經濾器過濾，4℃保存。
在實驗中，可以先配制相應pH值的高濃度母液，在使用時
進行稀釋。如：
（1）1 M Tris-HCl，pH=8.0
稱取60.57 g Tris溶于400 mL 三蒸水中，充分溶解，調pH至8.0，補加三蒸水定容至500 mL。用0.22 μm 濾膜過濾，置于玻璃瓶中4℃保存。
（2）2.5 M NaCl，pH=8.0
稱取36.53 g NaCl溶于200 ml 三蒸水中，充分溶解，調pH至8.0，補加三蒸水定容至250 mL。用0.22 μm 濾膜過濾，置于玻璃瓶中4℃保存。
（3）1 M 咪唑，pH=8.0
稱取17.02 g 咪唑溶于200 mL 三蒸水中，充分溶解，調pH至8.0，補加三蒸水定容至250 mL。用0.22 μm 濾膜過濾，置于玻璃瓶中4℃保存。
步驟
樣品制備
將經過IPTG誘導的菌液離心，7000 rpm，10 min。收集菌體細胞，用PBS漂洗兩遍，再用純化所用的平衡液漂洗一遍，zui后用平衡液重懸（35 mL/g 菌體沉淀），將收集好的菌液超聲破碎，直至澄清，13000 rpm，離心10 min，取上清，用0.45 μm 濾器過濾。
純化過程
1. 準備
將保存于4℃的試劑開蓋超聲脫氣40 min，平衡到純化的溫度。
2. 裝柱
裝柱前先在柱子內加滿三蒸水，打開開關至zui大流速，使三蒸水快速流過柱子以去除柱子中的氣泡。將凝膠填料從4℃冰箱內取出，用吸管將上層20%乙醇吸走，加入三蒸水輕輕重懸，緩緩加入柱內，加滿三蒸水，打開開關至zui大流速，保持柱子垂直，使凝膠壓緊，必要時可以用注射器從出口輕吸，給凝膠一定負壓，使凝膠壓的更緊密。
3. 平衡
提前打開紫外檢測儀，調節波長至280 nm，靈敏度為100%，預熱。向柱內加滿結合緩沖液，打開開關，使液體勻速向下流（3 mL/min）。此時，調節光量，使吸光值保持100穩定，此時為調滿。待吸光值穩定后，調節靈敏度為0.5 A/0.2 A，使吸光值保持0穩定，此時為調基線。
4. 上樣
將提前處理好的樣品加入20 mM 咪唑，有時可根據不同蛋白特性適當提高上樣咪唑濃度，以減少非特異性結合。沿壁緩緩加入柱內，盡量避免氣泡的產生。打開開關，保持盡量較低的流速（1 mL/min），待吸光值大于20時，用50 ml 離心管接流出的蛋白溶液，稱流穿。流穿內的蛋白應為未與凝膠結合的菌體蛋白。
5. 洗滌
沿壁緩緩加入結合緩沖液，打開開關，走大于10柱體積的結合緩沖液，流速3 mL/min。使吸光值恢復到基線或接近于基線水平。
6. 洗脫
初次純化一個新的重組蛋白一般選擇40 mM、60 mM、80 mM 咪唑作為流洗濃度，主要洗脫非特異結合在凝膠中的菌體蛋白，100 mM、200 mM、300 mM 咪唑作為洗脫濃度，主要洗脫目的蛋白，500 mM 咪唑洗脫與凝膠結合較頑固的蛋白。將每個洗脫濃度的蛋白進行SDS電泳檢測，確定洗脫雜蛋白以及目的蛋白的*濃度，作為以后洗脫條件。每個濃度洗滌（脫）時，都要使吸光值達到一個穩定的zui低值。一般作為流洗的洗滌液盡量多一些。
7. 平衡
zui后洗脫結束后，加入結合緩沖液，直至吸光值平衡基線或接近于基線水平。
8. 保存
向柱內緩緩加入5倍凝膠體積的20%乙醇，使凝膠充分浸在乙醇中。zui后，用乙醇慢慢重懸凝膠，取出置于干凈的離心管中，用乙醇沖洗柱子幾次，使凝膠的損失達到zui小。做好使用記錄，4℃保存凝膠。
9. 透析
（1）將存放于4℃的透析袋從水中（用于煮透析袋的去離子水）取出，戴一次性手套，去掉水，將一頭折起，用封閉夾封閉。透析液試漏。
（2）倒掉透析液，將不同梯度洗脫的蛋白加入透析袋內，上口折起，用封閉夾封閉。檢查不漏后放入2 L 透析液中。
（3）用玻璃棒將透析袋固定在燒杯內，以防止透析袋隨透析液轉動，影響透析效果，4℃透析，兩小時后更換透析液，然后透析過夜。
10. 電泳檢測
上樣、流穿、洗滌、各個梯度洗脫的蛋白，每個樣品取20 μL，加入等量2×SDS-buffer，沸水煮樣8 min，進行SDS-PAGE電泳檢測。常溫染色過夜，為避免染色時污染，染色液僅回收一次。
蛋白濃度測定
每純化出的蛋白在保存之前都要進行
蛋白濃度測定方法如下：
取5 mL 考馬斯亮藍G-250置于干凈試管中，空白對照加入100 μL 0.9%NaCl，測定組加入適量（考馬斯亮藍G-250由棕紅色變為藍色為止）未知蛋白，用0.9%NaCl補齊到100 μL，混勻，放置5 min。用721型分光光度計（需提前預熱20 min）測定其595 nm的吸光值（玻璃比色皿，用空白對照調0），帶入標準曲線，得出蛋白濃度。做好標記，保存于-20℃。
蛋白濃縮
若純化出的蛋白濃度過低，在濃度測定之前要使用超濾杯或硫酸銨沉淀的方法對其進行濃縮。
1. 超濾杯使用
使用前先將超濾杯用三蒸水涮洗三遍，然后在超濾杯內加入三蒸水，3000 rpm，離心10 min，目的將濾膜*清洗干凈。倒掉三蒸水，加入待濃縮的蛋白樣品，3000 rpm，離心，直至達到所需體積后停止離心，將濃縮后的蛋白樣品取出，進行電泳檢測和蛋白濃度測定。超濾杯如同使用前用三蒸水涮洗三遍，加入三蒸水，3000 rpm，離心10 min。zui后加入20%乙醇，是濾膜浸泡在乙醇中，4℃保存。
2. 硫酸銨沉淀法
蛋白溶液與飽和硫酸銨按1：1比例混合，4℃放置30 min，13000 rpm離心10 min，棄掉上清，沉淀的蛋白用500 μL PBS溶解（可根據沉淀的量適當增加PBS用量），溶解后用透析液透析。
注意事項
1. 保存于4℃的純化液體每次使用前須脫氣40分鐘，以防止純化過程中凝膠進氣。
2. 樣品在上樣之前要用0.45 μm 濾器過濾。
3. 每一種蛋白都有其*的特性，緩沖液中任何一個條件（pH值、鹽離子成分、鹽離子濃度）不適合，都會導致蛋白析出緩沖液中各成分的濃度并不是一定的，可根據不同蛋白的特性進行適當的調整。
