醫療污水處理設備實驗流程：

1 材料與方法

　　1.1 樣品采集

　　本實驗樣品取自江蘇某醫藥化工園區廢水處理廠, 該廢水廠主要功能是處理園區各醫藥化工企業排放的工業廢水, 納入廢水廠管網的廢水包括抗生素中間體廢水及nong藥中間體廢水等多種醫藥化工廢水.該廢水廠日處理量10萬t, 收集的廢水中含β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類和四環素類等幾大類抗生素生產過程中產生的高濃發酵廢水、化學合成廢水、其他制劑廢水及混合廢水(清洗水、冷卻循環水和生活污水等).廢水中含大量殘留的抗生素原材料、副反應產物, 還含有機溶劑二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、四qing呋喃和二氯甲烷等.廢水廠主要采用厭氧-缺氧-好氧(A2O)工藝.本實驗樣品為活性污泥, 具體取自*混合式好氧生物處理池.取樣時先在池內前中后三段各取約500 mL泥水混合樣品, 以保證樣品具有代表性, 現場混合均勻后, 用無菌50 mL離心管分裝后冰袋低溫冷藏, 當日即進行基因組DNA提取.

　　1.2 基因組DNA提取

　　使用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA)試劑盒根據產品操作手冊提取樣品基因組DNA.采用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA樣品的質量和完整性.用NanoDropTM 2 000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)和Qubit® 2.0熒光光譜儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)檢測DNA的產量和純度.基因組DNA樣品用干冰保藏并立即送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序.

醫療污水處理設備實驗流程：

1.3 ARGs生物信息學分析

　　采用Illumina HiSeq Xten平臺進行PE150雙端測序.首先對原始測序數據進行質量控制, 去除堿基數大于40 bp但是其質量分數低于38的序列, 去掉歧義核苷酸超過10個的序列, 去掉與adapter序列有15 bp重疊的序列.采用SOAPdenovo軟件組裝clean reads.當選擇zui高的scaffold N50 value來進行進一步分析時, 選擇不同的K-mer值(49、55和59)用于使用于不同的-d1、-M3、-u和-F參數.將得到的scaffold片段在N段打斷, 進而得到scaftig片段.僅僅大于500 bp的scaftig片段被保留以作進一步分析.采用默認參數的MetaGeneMark軟件從組裝好的scaftig片段來預測開放閱讀框(ORFs), 采用CD-HIT來獲得非冗余基因.采用SOAPaligner軟件將保留的clean read與基因庫進行比對, 以計算匹配的數目.通過去除含有少于3個mapped reads映射片段的基因類別來獲得unigene.用DIAMOND軟件將unigene與NCBI-NR數據庫進行比對, 設置blastp參數e-value≤1e-5, 并且采用MEGAN軟件LCA算法進行注釋.采用DIAMOND軟件(blastp, evalue ≤ 1e-5)將unigene對應的蛋白序列在KEGG數據庫、eggNOG數據庫和CAZy數據庫中進行比對.利用BLAST軟件(blastp, evalue≤1e-5)將unigene在CARD數據庫進行比對, 進行ARGs注釋.采用Cytoscape軟件進行網絡分析, 以研究ARGs與微生物分類的關系.

2 結果與討論

　　2.1 醫藥化工污水廠中微生物群落結構

　　在該好氧活性污泥樣品中, 經過質量控制后, 共得到reads數目109 523 076條, 并由此組裝得到55 255個scaftig, 并預測了105 892個unigene.利用DIAMOND軟件將unigene在NCBI-NR數據庫中進行比對, 后續用MEGAN軟件進行注釋, 統計樣本在門水平(表 1)及屬水平(圖 1)上的*個豐度zui大的群落組成.